編譯：永稷，編輯：小菌菌、江舜堯。
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導(dǎo)讀花是必要且不可或缺的植物器官，暴露于傳粉昆蟲和花食動(dòng)物。但是有關(guān)花的化學(xué)防御卻鮮為人知。
本研究表明：位于擬南芥5號(hào)染色體上的萜類合成酶和細(xì)胞色素P450編碼基因（TPS11和CYP706A3）在開花期和花芽發(fā)育期與花器官的形成緊密共表達(dá)，其中TPS11可調(diào)控產(chǎn)生多種倍半萜烯類揮發(fā)性物質(zhì)。
TPS11和CYP706A3在酵母真核表達(dá)系統(tǒng)和煙草植株中進(jìn)行共表達(dá)結(jié)果表明：CYP706A3可激活TPS11，并進(jìn)一步氧化其初級(jí)氧化產(chǎn)物。對(duì)cyp706a3及其35s突變體的柱頭和可溶性代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析表明：CYP706A3會(huì)大大抑制倍半萜烯類化合物和絕大多數(shù)的單萜類化合物從花中的釋放并在花器官中產(chǎn)生萜類氧化物。在花芽中，TPS11和CYP706A3的共同表達(dá)也會(huì)抑制揮發(fā)物的釋放，產(chǎn)生可溶性性倍半萜烯類氧化物。對(duì)十字花科專性花食動(dòng)物小菜蛾測(cè)定表明： CYP706A3表達(dá)及萜類氧化物積累的花芽對(duì)昆蟲幼蟲具有趨避效應(yīng)。CYP706A3表達(dá)的花的微生物微生物組成也會(huì)發(fā)生變化。TPS11和CYP706a3在十字花科植物中會(huì)同時(shí)進(jìn)化并在更高等的植物中形成很多揮發(fā)性功能的基因簇。
原名：A Promiscuous CYP706A3 Reduces Terpene Volatile Emission from Arabidopsis Flowers, Affecting Florivores and the Floral Microbiome
譯名：混雜的CYP706A3減少了擬南芥花中的萜類揮發(fā)物釋放，從而影響了花食動(dòng)物和花卉微生物組
期刊：Plant Cell
IF：8.631
發(fā)表時(shí)間：2019.12
通訊作者：Danièle Werck-Reichhart
作者單位：法國(guó)斯特拉斯堡大學(xué)國(guó)家科學(xué)研究中心(CNRS)生物分子學(xué)研究所
1 CYP706A3和TPS11位于擬南芥5號(hào)染色體并在花中緊密共表達(dá)（闡述兩個(gè)基因的發(fā)現(xiàn)及位置）
CYP706A3和TPS11是與細(xì)胞色素P450基因緊密共表達(dá)的萜烯合酶基因。采用BAR Expression Angler方法研究表明：當(dāng)運(yùn)用“Extended Tissue Compendium”數(shù)據(jù)集時(shí)，TPS11是CYP706A3最緊密共調(diào)控的基因(Figure 2A)。同樣地，CYP706A3是P450基因中與TPS11最緊密共調(diào)控的基因。兩個(gè)基因在空間發(fā)育中共表達(dá)，可在花期12-15的心皮中以及在芽頂端分生組織和花序頂端的樣品中檢測(cè)到最高水平的表達(dá)。在花期花的心皮中這些基因的共表達(dá)可通過RT-qPCR技術(shù)得到進(jìn)一步的證實(shí)(Figure 2B)。器官基因組學(xué)進(jìn)一步證實(shí)了該假設(shè)：CYP706A3和TPS11是擬南芥5號(hào)染色體上兩個(gè)連接基因，被5kb的非編碼序列所分隔且轉(zhuǎn)錄方向相反(Figure 2C)。這也就表明：這兩個(gè)基因可能形成了一個(gè)更大的代謝基因簇的核心。兩個(gè)編碼s-腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶的基因經(jīng)預(yù)測(cè)均位于質(zhì)粒中，且表達(dá)譜與其他部位的TPS11和CYP706A3不匹配，其他基因不太可能參與萜烯類代謝途徑(Figure 2C)。此外，沒有與TPS11/CYP706A3位點(diǎn)緊密相關(guān)的代謝基因是BAR Expression Angler中絕大多數(shù)共表達(dá)基因列表中的一部分。很可能TPS11和CYP706A3形成了由兩個(gè)共轉(zhuǎn)錄基因所組成的一個(gè)小的代謝基因簇。圖2. CYP706A3和TPS11位于擬南芥5號(hào)染色體并在花中緊密共表達(dá)。A. 與CYP706A3共調(diào)控的25個(gè)基因的表達(dá)熱點(diǎn)圖；B.植物(左)和花(右)器官中CYP706A3和TPS11的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平; C.5號(hào)染色體上CYP706A3和TPS11基因簇的圖譜(上)和兩個(gè)基因間的內(nèi)含子/外顯子和基因組距離的表達(dá)(下)。
2 在酵母系統(tǒng)中，CYP706A3氧化了主要的TPS11產(chǎn)物
為了驗(yàn)證兩個(gè)基因簇基因之間的功能相關(guān)性的假設(shè)，在酵母系統(tǒng)中對(duì)CYP706A3對(duì)TPS11產(chǎn)物的作用活性進(jìn)行測(cè)定，因?yàn)檎婧吮磉_(dá)系統(tǒng)-酵母體系是細(xì)胞色素P450酶更為適宜的寄主系統(tǒng)。分別將TPS11和CYP706A3的全長(zhǎng)序列在酵母系統(tǒng)中獨(dú)自表達(dá)，分別對(duì)表達(dá)TPS11和CYP706A3酵母系統(tǒng)中8 d后的頂部空間的氣體進(jìn)行收集，在產(chǎn)物高峰期可檢測(cè)到高達(dá)0.7 mg/L的TPS11主要產(chǎn)物(+)-α-barbatene(a) 和(+)-thujopsene (b)以及0.3 mg/L的CYP706 A3主要產(chǎn)物1。為了鑒定TPS11所產(chǎn)生的化合物是CYP706A3氧化的底物，以TPS11主要化合物(+)-α-barbatene and (+)-thujopsene接種到由CYP706A3所制備的微粒體質(zhì)膜中，發(fā)現(xiàn)(+)-α-barbatene可被CYP706A3轉(zhuǎn)化為純化組分16中的產(chǎn)物1和3，以及之前在混合酵母培養(yǎng)系統(tǒng)中檢測(cè)到的產(chǎn)物7和8。(+)-thujopsene以及純的(-)-thujop sene可被CYP706A3轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物2和4。對(duì)這些化合物的保留時(shí)間和質(zhì)譜結(jié)果與之前混合培養(yǎng)酵母系統(tǒng)中的組分11和16進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由α-barbatene代謝產(chǎn)生的1和3具有不同的結(jié)構(gòu)，而由α-barbatene代謝產(chǎn)生的化合物2和4的結(jié)構(gòu)相似，很可能是倍半萜烯類化合物。核磁光譜鑒定發(fā)現(xiàn)CYP706A3的主要產(chǎn)物是(+)-1-oxo-thujopsene非對(duì)映體以及(+)-6-oxo-α-barbatene and(+)-6-OH-α-barbatene非對(duì)映體的混合物。通過高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)和液相雙質(zhì)譜技術(shù)對(duì)酵母表達(dá)系統(tǒng)頂部空間氣體的樣本進(jìn)行純化并在活體上進(jìn)行接種分析。對(duì)組分11和16中的化合物1,2,3和4進(jìn)行氣質(zhì)和核磁結(jié)構(gòu)驗(yàn)證。純化的組分11和16中分別含有CYP706A3所產(chǎn)生的羅漢柏烯和barbatene氧化物，將其接種到從CYP706A3酵母表達(dá)系統(tǒng)中分離得到的微粒體膜上。LC-MS/MS對(duì)最終的反應(yīng)培養(yǎng)基提取物進(jìn)行分析CYP706A3對(duì)thujopsene和barbatene氧化產(chǎn)物均具有活性。初級(jí)氧化產(chǎn)物(+)-α-barbateneoxidation(fraction 16)可被CYP706A3轉(zhuǎn)化成為5,6,7和8，而(+)-thujopsene(fraction 11)而被CYP706A3可被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為9,10和11。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物的保留時(shí)間和質(zhì)譜表明絕大多數(shù)次級(jí)代謝產(chǎn)物可進(jìn)一步被氧化。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明CYP706A3對(duì)(+)-α-barbatene, (+)-thujopsene以及它們各自氧化產(chǎn)物具有連續(xù)的氧化活性，如圖4所示。圖4 CYP706A3對(duì)植物TPS產(chǎn)物的催化反應(yīng)。
3 CYP706A3在煙草中的表達(dá)說明其對(duì)TPS11產(chǎn)物具有更為廣譜的顯著活性
為了進(jìn)一步確定CYP706A3在植物環(huán)境中對(duì)TPS11的活性，對(duì)相關(guān)基因在煙草葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。與TPS11酵母表達(dá)系統(tǒng)一致，TPS11煙草表達(dá)系統(tǒng)的頂部空間氣體中葉可以檢測(cè)到相同比例的倍半萜烯類物質(zhì)(Figure 5A)。CYP706A3與TPS11在煙草中的共表達(dá)所產(chǎn)生的CYP706A3主要產(chǎn)物1,2,3和4，在酵母共表達(dá)系統(tǒng)中也均可檢測(cè)到，隨之而來的減少了所有TPS11產(chǎn)品的排放，盡管程度不同(Figure 5A-B)。萜烯結(jié)構(gòu)對(duì)于多環(huán)類化合物barbatene, thujopsene, chamigrene,cuprenene, isobazzanene and acoradiene釋放的降低多于單環(huán)和環(huán)狀化合物，如三聚氰胺、倍半烯、姜烯、法尼烯。TPS11化合物釋放的降低并不是由于其與另一個(gè)蛋白的共表達(dá)而降低了TPS11化合物的生產(chǎn)潛力。總而言之，TPS11和CYP706A3在煙草中的共表達(dá)證明植物中barbatene和thujopsene的形成依賴于CYP706A3，也表明CYP706A3的混合使得絕大多數(shù)TPS11產(chǎn)物被氧化成為更多體積龐大的多環(huán)倍半萜烯類化合物。圖5 在本氏煙中瞬時(shí)共表達(dá)顯示CYP706A3對(duì)多個(gè)TPS11產(chǎn)物的活性。
4 CYP706A3將花中的倍半萜烯和單烯物質(zhì)氧化為萜類物質(zhì)
運(yùn)用CYP706A3及其35s:cyp706A3突變體對(duì)擬南芥花中TPS11和CYP706A3的相關(guān)功能進(jìn)行研究。構(gòu)建CYP706A3兩個(gè)獨(dú)立的T-DNA群體，一個(gè)是啟動(dòng)子cyp706a3-1，另一個(gè)是編碼序列cyp706A3-2，從而導(dǎo)致cyp706A3在花中轉(zhuǎn)錄缺失。通過用花椰菜花葉病毒（CaMV）35S：CYP706A3構(gòu)建體轉(zhuǎn)化Col-0產(chǎn)生異位過表達(dá)細(xì)胞系。對(duì)野生型和突變擬南芥植株的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)CYP706A3缺失會(huì)導(dǎo)致TPS11釋放產(chǎn)物的急劇增加(Figure 6A)。更加令人驚奇地是，CYP76A3的缺失也會(huì)增加由TPS21和TPS24所調(diào)控的其他倍半萜類和單萜類揮發(fā)性物質(zhì)的增加?？偠灾?，突變株所釋放的揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)的含量超過兩倍(Figure 6B)。同樣地，CYP706A3過表達(dá)株系所釋放的揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)急劇減少。突變株中不同化合物更加精確的定量表明所有的揮發(fā)性萜類物質(zhì)均不會(huì)被CYP76A3以同樣的效率進(jìn)行氧化，這與煙草突變株中所得到的結(jié)果相一致。此外，在CYP706A3突變株中barbatene氧化物1和3以及thujopsene氧化物2和4的含量與野生型相比大大減少。這些初級(jí)氧化產(chǎn)物在CYP706A3過表達(dá)株系中不再增加，這與活體實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。對(duì)CYP706A3突變株頂部空間所收集氣體的分析更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CYP706A3對(duì)TPS21和TPS24所調(diào)控產(chǎn)物的復(fù)雜的氧化活性。通過TPS21或TPS24酵母及煙草共表達(dá)系統(tǒng)對(duì)CYP706A3的活性進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證，及共表達(dá)系統(tǒng)中萜類物質(zhì)的混合產(chǎn)物顯著減少。CYP706A3對(duì)TPS21產(chǎn)物的氧化活性導(dǎo)致了酵母及煙草系統(tǒng)中氧化產(chǎn)物的釋放，這通過E-β-caryophyllene接種試驗(yàn)得到證實(shí)。相反，在TPS24和CYP706A3共表達(dá)系統(tǒng)中未檢測(cè)到揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)。CYP706A3會(huì)將TPS單萜類產(chǎn)物氧化為未知的氧化產(chǎn)物，絕大多數(shù)CYP706A3氧化產(chǎn)物均可溶而儲(chǔ)存在植物組織中。
4 CYP706A3蛋白的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)、對(duì)昆蟲產(chǎn)生了趨避作用以及對(duì)花中細(xì)菌群落的影響
與大多數(shù)其他P450酶相比，CYP706A3表現(xiàn)出不同尋常的混雜性。它的作用在倍半烯基和單萜類化合物，此外，還可以對(duì)相同的底物產(chǎn)生連續(xù)的氧化反應(yīng)。為了理解這種混雜的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，使用多模板方法生成了酶的3D同源性模型，并基于序列同一性和通過HMM配置文件搜索遠(yuǎn)距離同源物來迭代搜索模板。評(píng)估并比較了從檢測(cè)到的模板的各種組合重建的CYP706A3模型。最佳同源性模型產(chǎn)生了最高的QMEAN4評(píng)分，是從三模板構(gòu)建中獲得的。通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)展示了兩個(gè)主要的通道，一個(gè)顯著疏水的通道連接到膜，另一個(gè)不那么疏水的指向膜-水界面（圖9A）。CYP706A3血紅素口袋顯示出一個(gè)很小，受約束且基本疏水的空腔（圖9B），該空腔主要由無極性殘基（Ile130，Ala383，Val382，Val387，Gly318，Leu386）組成，除了第一冠中僅有的極性殘基Thr322在血紅素平面上方（圖9B和C）?？涨坏纳喜恳仓饕鞘杷模?/span>Val497，Ile496，Trp131，Leu317和Leu229），帶有一個(gè)帶電荷的殘基（Asp321）?？傊?，這些特性使活性位點(diǎn)很好地適應(yīng)萜類化合物（如倍半萜），如血紅素附近的（）-thujposene和（）-α-barbatene的良好模型擬合說明了這一點(diǎn)（圖9C-9D）。在該結(jié)構(gòu)模型中不同倍半萜烯的分子對(duì)接產(chǎn)生了令人驚奇的同質(zhì)性分布，在大多數(shù)情況下具有與觀察到的新陳代謝相對(duì)應(yīng)的主要的或唯一的排名最好的基因簇。thusjopsene被發(fā)現(xiàn)通過雙鍵堆疊在血紅素卟啉環(huán)上，與主要氧化產(chǎn)物1-oxo一致，烯丙基（C11，圖9E）和乙烯基位置（C1）的鐵碳距離最短-thujopsene。對(duì)TPS11/CYP706A3在花對(duì)傳粉昆蟲潛在的防御作用進(jìn)行了研究。探索到底是TPS11單獨(dú)表達(dá)所釋放出的揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)還是TPS11和CYP706A3共表達(dá)系統(tǒng)所釋放出的揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)對(duì)昆蟲產(chǎn)生趨避作用。對(duì)CYP706A3的產(chǎn)物進(jìn)行分離純化鑒定，結(jié)果表明未氧化的倍半萜烯類化合物會(huì)吸引昆蟲，而倍半萜烯類物質(zhì)氧化后的產(chǎn)物會(huì)抑制昆蟲。與該趨勢(shì)一致的是，昆蟲更喜歡TPS11表達(dá)所產(chǎn)生的產(chǎn)物而非TPS11和CYP706A3共表達(dá)所產(chǎn)生的混合產(chǎn)物，從而確定氧化后產(chǎn)物的驅(qū)蟲活性。就CYP706A3表達(dá)對(duì)花微生物群落的影響進(jìn)行研究。對(duì)擬南芥野生型、CYP706A3以及35S:cyp706A3三種植物材料的花的細(xì)菌DNA進(jìn)行提取并測(cè)序?；?/span>DNA序列的相似性進(jìn)行分類單元的確定，并進(jìn)一步進(jìn)行豐度、多樣性和微生物組成的比較研究。隨機(jī)森林分析表明野生型花的細(xì)菌分類單元與兩種突變體的分類單元不重疊(Figure 10B)。用最小二乘判別分析進(jìn)一步對(duì)每種花的分類單元進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明不同類型的花的微生物組有所不同(Figure 10C)。為了明確每個(gè)花系的OTUs，我們進(jìn)行了單變量分析(圖10D)。結(jié)果顯示，47個(gè)OTUs在三種植株花中有顯著性差異的定殖模式。具體來說，有20和25個(gè)otu 顯著富集了定植于CYP706A3 -2和35S:CYP706A3的花，其中有20個(gè)在野生型上幾乎檢測(cè)不到或缺失。相比之下,19個(gè)19個(gè)out在野生型花中被發(fā)現(xiàn),但分別有14個(gè)OTU和6個(gè)OUT在cyp706a3-2和 35S:CYP706A3的花中幾乎檢測(cè)不到或缺失。這些結(jié)果表明：CYP706A3所氧化產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在特異性微生物在擬南芥花中的定殖中具有重要的作用。圖9 CYP706A3活性位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)模型及相關(guān)底物的比較對(duì)接。
圖10 CYP706A基因簇化產(chǎn)物影響了花的驅(qū)蟲行為和花的微生物種群。
本研究數(shù)據(jù)表明，依賴于CYP706A3萜類氧化物質(zhì)對(duì)花微生物具有選擇性。細(xì)菌豐度、多樣性和組成的分析表明每個(gè)花基因型都具有特殊的微生物群體(Figure 10C)。cyp706a3和 35S:CYP706A3突變寄主的細(xì)菌群體OUT較野生型豐富，這一結(jié)果與萜類氧化物通過減少細(xì)菌定殖，從而減少野生型植株花多樣性相一致。判別分析結(jié)果可視化清楚的展示了花基因型與群體的相關(guān)性。不同基因型植株微生物群體組成的差異提高了所有OUT不會(huì)被相同的影響的可能性。因此，我們發(fā)現(xiàn)植物對(duì)其微生物的影響具有特異性。例如，35S:CYP706A3突變體植株中所發(fā)現(xiàn)的高豐度的OTUs中，532個(gè)OTUs與假單胞菌的親和性較高。與這一結(jié)果相一致的是，在倍半萜類物質(zhì)積累的茄科植物中也存在假單胞菌。該屬微生物能夠促進(jìn)萜類化合物的氧化。相反地，本研究發(fā)現(xiàn)定殖于野生型擬南芥中花中的特異性OTUs在cyp706a3和35S:CYP706A3突變體花中缺失。
總的來說，本研究結(jié)果表明TPS11和CYP706A3基因簇有助于調(diào)控?cái)M南芥花上的細(xì)菌群體。該結(jié)果與早期揮發(fā)性有機(jī)化合物形成了細(xì)菌群體的多樣性和組成這一結(jié)果相一致。最新研究表明花微生物組的移除會(huì)導(dǎo)致花中萜類物質(zhì)的釋放以及花代謝的變化。除此之外，表面細(xì)菌改變了花芳香氣味的釋放。反之亦然，花揮發(fā)性物質(zhì)也會(huì)影響微生物在花中的定殖。比如擬南芥中TPS21所調(diào)控的石竹烯，其會(huì)保護(hù)植物不被細(xì)菌性病原菌Pseudomonas syringae所侵染。細(xì)菌亞群的器官特異性生態(tài)作用以及它們對(duì)花卉健康的優(yōu)勢(shì)仍有待確定。此外，CYP706A3對(duì)底物和產(chǎn)物的選擇性對(duì)相關(guān)微生物群體的影響仍需進(jìn)一步的研究。多種生物的交互作用的復(fù)雜程度與花相關(guān)微生物組以及花入侵者之間緊密相關(guān)。
該篇論文創(chuàng)新點(diǎn)在于對(duì)“植物-植物微生物-花食昆蟲”三者的互作進(jìn)行了研究，通過代謝組學(xué)、代謝物表達(dá)調(diào)控、微生物組學(xué)和殺蟲活性等試驗(yàn)，對(duì)植物花對(duì)取食昆蟲的這一現(xiàn)象背后的機(jī)制進(jìn)行了深入的闡述。特別突出了微生物在植物表型中的重要作用，為利用微生物進(jìn)行作物改良、植物保護(hù)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，是微生物組與植物互作研究中的典范，值得借鑒。
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