易點(diǎn)評(píng)
循環(huán)外泌體RNA（尤其是miRNA）已經(jīng)成為檢測(cè)早期癌癥的最具前景的生物標(biāo)志物之一。本研究即是一例循環(huán)外泌體作為宮頸癌早期篩查潛在標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)案例。
背景
宮頸癌(CC)是20至39歲女性患癌癥致死的第二大病因。其發(fā)病率和死亡率分別為98.9/10萬(wàn)和30.5/10萬(wàn)，且在中國(guó)有上升趨勢(shì)。宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的CC篩查對(duì)于識(shí)別高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、防止其發(fā)展為浸潤(rùn)性癌具有重要意義。篩查方式一般為巴氏涂片(巴氏涂片)和Thinprep細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)(TCT)，通過(guò)篩查可以極大地降低宮頸癌的發(fā)病率，并提高宮頸癌的5年存活率。然而，巴氏涂片和TCT的診斷率仍然較低，這是由于早期篩查并不是在中國(guó)所有的地區(qū)都得到了普及，特別是在農(nóng)村地區(qū)，大多數(shù)女性在出現(xiàn)陰道異常出血、白帶、腹痛等癥狀時(shí)才會(huì)進(jìn)行檢查。
外泌體是存在于所有體液中的30-150 nm的微小囊泡，是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)液體活檢的關(guān)鍵指標(biāo)之一。外泌體可以提供豐富的遺傳物質(zhì)，包括DNA片段、mRNA、長(zhǎng)非編碼RNA、小RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，它們與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。與長(zhǎng)非編碼RNA、無(wú)細(xì)胞DNA的異質(zhì)性突變位點(diǎn)和mRNA的不穩(wěn)定特性等復(fù)雜機(jī)制相比，外泌體miRNA穩(wěn)定且相對(duì)不可降解，檢測(cè)方法相對(duì)成熟，并且最近的研究表明，外泌體miRNA有可能成為癌癥篩查、診斷和監(jiān)測(cè)的有效生物標(biāo)志物。例如，5-miRNA可以區(qū)分惰性前列腺癌和侵襲性前列腺癌。miR-122、miR-192、miR-17-5p和miR-25-3p分別在不同的腫瘤組織中富集。一些來(lái)自血漿或血清的miRNA已經(jīng)顯示出它們作為宮頸鱗癌(SCC)手術(shù)前后和早期發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌的非侵襲性生物標(biāo)志物的潛力。
在本研究中，作者對(duì)癌癥生物標(biāo)記物開(kāi)展了大規(guī)模的血漿miRNA研究。對(duì)121例健康志愿者、宮頸癌患者和癌前病變患者的血漿樣本進(jìn)行了外泌體miRNA測(cè)序。然后用qRT-PCR驗(yàn)證了46例宮頸癌及其癌旁組織中差異表達(dá)的miRNA(DEmiRs)。此外，使用ddPCR進(jìn)一步驗(yàn)證了其中兩個(gè)DEmiRs(miR-30d-5p和let-7d-3p)在203份獨(dú)立的血漿樣本中的差異性，證實(shí)了這兩種外泌體miRNA的聯(lián)合應(yīng)用在宮頸癌的早期檢測(cè)中是有效且具有前景的。
結(jié)果
外泌體中差異表達(dá)miRNA的鑒定
首先，對(duì)檢測(cè)到的所有DEmiRs進(jìn)行主成分分析(PCA)和聚類分析，并將血漿樣本按照相似miRNA表達(dá)模式進(jìn)行分配(圖1)。作者發(fā)現(xiàn)，CIN II-III和CC組樣本具有共同的miRNA表達(dá)情況。此外，作者還比較了健康受試者和CINⅠ受試者miRNA的表達(dá)，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)DEmiRs(FDR>0.05)。這些結(jié)果印證了分組策略，即將CIN II-III、ACC和SCC患者合并為一組，而將健康受試者和CIN I患者合并為另一組。最后，CIN I-與CIN II+組比較發(fā)現(xiàn)了37個(gè)DEmiR(FDR<0.01)，其中9個(gè)表達(dá)上調(diào)，28個(gè)表達(dá)下調(diào)。
外泌體miRNA鑒別CIN I-和CIN II+患者的診斷準(zhǔn)確性
接下來(lái)，使用隨機(jī)森林算法從121個(gè)血漿外泌體測(cè)序樣本的37個(gè)DEmiR中選擇一組miRNA，確定了具有8個(gè)miRNA(let-7a-3p、let-7d-3p、miR-30d-5p、miR-144-5p、miR-182-5p、miR-183-5p、miR215-5p和miR-4443)的組合，它們是臨床診斷中鑒別CIN I-與CIN II+最有效的預(yù)測(cè)因子。這八個(gè)miRNA的等級(jí)聚類表明，只有兩個(gè)CIN II+患者被錯(cuò)誤地歸入CIN I-組(圖1)。ROC分析進(jìn)一步評(píng)估了miRNA標(biāo)記區(qū)分CIN II+和CIN I-受試者的敏感性和特異性，統(tǒng)計(jì)出AUC值為0.992(圖1)。綜上所述，新發(fā)現(xiàn)的8個(gè)miRNA對(duì)CIN I-和CIN II+有很高的預(yù)測(cè)性。
miRNA的途徑富集分析
為了進(jìn)一步了解這些miRNA在CC中的分子功能，我們對(duì)這些miRNA進(jìn)行了富集分析。在8個(gè)DEmiRs的富集途徑中，有25個(gè)顯著相關(guān)通路(FDR<0.01)，其中5個(gè)是與腫瘤相關(guān)的通路，如細(xì)胞周期、p53信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路等，值得注意的是，最主要的靶向途徑是病毒致癌，這與HPV引起的CC是一致的。此外，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和雌激素信號(hào)通路也很重要。并且，miR-30d-5p、miR-182-5p和miR-183-5p同時(shí)調(diào)控RAC1、IGF1R、NRAS、TP53和CCND1基因，這些基因參與了大部分上述重要途徑。這些結(jié)果表明，這8個(gè)外泌體miRNA不僅可以作為潛在的診斷生物標(biāo)志物，并且由于它們?cè)诠δ苌蠀⑴c了CC的發(fā)生和發(fā)展，還可以被當(dāng)作潛在的抗癌藥物靶點(diǎn)。
圖1
qRT-PCR驗(yàn)證候選標(biāo)志物miRNA的有效性
作者使用qRT-PCR評(píng)估了46例CC患者的癌組織和癌旁組織中用于區(qū)分CIN I-和CIN II+的最佳小組中的8個(gè)DEmiRs。其中5個(gè)miRNA(let-7a-3p、let-7d-3p、miR-30d-5p、miR-183-5p和miR-182-5p)在血漿外泌體中表現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)，3個(gè)(let-7a-3p、let-7d-3p和miR-30d-5p)在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)存在顯著差異。然而，8個(gè)miRNA中的另外3個(gè)(miR-215-5p、miR-144-5p和miR-4443)在組織中與血漿外泌體中沒(méi)有出現(xiàn)明顯變化。
ddPCR在獨(dú)立血漿樣本中驗(yàn)證miRNA的有效性
血漿外泌體測(cè)序let-7d-3p和miR-30d-5p的表達(dá)組合，在121個(gè)訓(xùn)練樣本中AUC值為0.922。而在203個(gè)測(cè)試樣本中，這兩個(gè)DEmiR的AUC值為0.828(圖2)。此外，在203份有效樣本中，基于細(xì)胞學(xué)測(cè)試的樣本的AUC值為0.766，而基于miRNA的AUC值增加到了0.834，并且在基于細(xì)胞學(xué)測(cè)試的模型中進(jìn)一步整合這兩個(gè)miRNA得到了更高的AUC值0.887(圖2)。
外泌體和組織間miRNA表達(dá)差異的研究
為了確定miRNA的空間分布和表達(dá)水平，作者還用ddPCR方法檢測(cè)了7個(gè)miRNA(miR-320a、miR-128-3p、miR-129-5p、let-7d-3p、let-7i-5p、miR-30d-5p和miR-30a-5p)在CC患者血漿外泌體以及癌旁正常組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示在組織和外泌體之間存在不同的表達(dá)情況。這些miRNA在組織中的比例分別為57.5%、0.5%、2.9%、5.7%、9.1%、10.3%和13.9%，在外泌體中分別為23.8%、22.8%、5.3%、7.5%、4.5%、18.2%和17.9%。外泌體與組織間miRNA表達(dá)豐度的Spearman相關(guān)系數(shù)僅為0.321(P=0.498)，這表明外泌體miRNA可能是由腫瘤細(xì)胞選擇性分泌的。
圖2
結(jié)論
本研究是一項(xiàng)癌癥生物標(biāo)記物的大型血漿miRNA研究。鑒定出了外泌體miR-30d-5p和let-7d-3p是宮頸癌及其癌前病變非侵襲性篩查有前景的診斷生物標(biāo)志物。在臨床上，抽血比TCT或巴氏涂片檢查更加便捷，并且陰道或?qū)m頸感染的風(fēng)險(xiǎn)更低。同時(shí)，它還可以納入常規(guī)血液檢測(cè)，這大大提高了臨床的檢驗(yàn)效率。此外，血漿外泌體中的miRNA是穩(wěn)定的，對(duì)物理降解具有抵抗力，這是它們能夠成為宮頸癌篩查最有前途的診斷生物標(biāo)志物的原因之一。然而，在應(yīng)用到臨床診斷之前，還需要使用大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。對(duì)這些miRNA的功能研究為宮頸癌進(jìn)展過(guò)程中的機(jī)制和生理相關(guān)性提供了新的見(jiàn)解。
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