建武新政府在初政政策上出現(xiàn)諸多失誤。賞賜方面，辜負(fù)了武士們的期待，結(jié)果武士對(duì)新政越來越失望，希望復(fù)興武家政治的武士變得越來越多。如此形勢(shì)下，公武之間產(chǎn)生激烈的對(duì)抗。作為代表，擔(dān)負(fù)武士們的眾望的足利尊氏與對(duì)足利尊氏抱有警戒心的護(hù)良親王的對(duì)立表面化。護(hù)良親王謀劃襲擊足利尊氏，等待時(shí)機(jī)，由于足利尊氏用強(qiáng)大的兵力守衛(wèi)自身，護(hù)良親王的計(jì)劃未能成功。建武元年（1334年）十月，足利尊氏對(duì)后醍醐天皇施加強(qiáng)大壓力，于是后醍醐天皇向足利尊氏屈服，下令捉拿護(hù)良親王。翌月，護(hù)良親王被護(hù)送到鐮倉的東光寺幽閉。
建武二年（1335年）七月，北條高時(shí)的遺子北條時(shí)行在關(guān)東舉兵，對(duì)新政不滿的近國武士們聚集，很快就成為極大的勢(shì)力。時(shí)行帶領(lǐng)大軍迫近鐮倉，足利直義迎擊，戰(zhàn)敗，之后殺死幽閉中的護(hù)良親王，奉成良親王西走。足利尊氏接報(bào)，向朝廷請(qǐng)求讓自己東下討伐北條時(shí)行，并要求擔(dān)任征夷大將軍和諸國勿追捕使。然而得不到敕許，結(jié)果成良親王成為征夷大將軍。如此足利尊氏沒有得到朝廷的準(zhǔn)許，在八月二日離京，在三河國與足利直義之勢(shì)合流，在各地?fù)羝婆衍婈懤m(xù)前進(jìn)，十九日收復(fù)鐮倉。此即中先代之亂。足利尊氏對(duì)諸將進(jìn)行賞賜，并停留于鐮倉。
四月三日，足利尊氏讓一色范氏等在九州留下，率領(lǐng)少二、大友等九州勢(shì)離開博多。途中與中國、四國勢(shì)會(huì)合，在備后的鞆兵分兩路，足利尊氏從海路，直義取陸路向東進(jìn)發(fā)。同月二十五日，在兵庫和田岬擊敗新田義貞軍，在湊川之戰(zhàn)全殲楠木正成的軍隊(duì)。后醍醐天皇在二十七日逃往比叡山，二十九日足利直義的軍隊(duì)進(jìn)入京都。足利尊氏也在六月十四日奉光嚴(yán)上皇及其皇弟豐仁親王進(jìn)京，八月十五日親王在沒有神器的情況下即位成為光明天皇。
之后兩軍也持續(xù)交戰(zhàn)，后醍醐天皇側(cè)由于名和長(zhǎng)年等人的戰(zhàn)死，敗勢(shì)逐漸變濃。天皇命令新田義貞奉恒良、尊良兩親王前往北陸，自己則于十月十日按照足利尊氏之前的邀請(qǐng)返京，十一月二日，授予光明天皇神器。如此建武新政在僅僅二年半后就宣告結(jié)束。
建武二年（1335年）十一月七日，足利尊氏公布二項(xiàng)十七條的建武式目，向天下宣布幕府的復(fù)興同時(shí)出示今后施政的基本方針。幕府的組織大體上從建武三年（1336年）到四年（1337年）得到確立。足利尊氏在期間得到北朝的委任，敘權(quán)大納言，歷應(yīng)元年（1338年）八月十一日就任征夷大將軍，同日位階進(jìn)入正二位，如此室町幕府正式成立。后醍醐天皇在建武三年（1336年）十二月二十一日秘密逃出京都，潛行至大和吉野，開設(shè)朝廷南朝與足利尊氏擁立的京都朝廷北朝對(duì)抗。如此兩個(gè)朝廷和兩個(gè)年號(hào)并立的南北朝六十年的內(nèi)亂就此開始。后醍醐天皇呼吁全國討滅足利氏，派遣皇子、諸將在各地努力扶植收復(fù)京都的勢(shì)力。作為對(duì)應(yīng)，足利尊氏任命一族為守護(hù)配置于各國，關(guān)東、九州等前代以來的有力豪族擁有守護(hù)職的地方設(shè)置關(guān)東管領(lǐng)、九州探題與南朝勢(shì)力對(duì)抗，以之做為全國支配的布局。
兩軍的戰(zhàn)斗在各地展開。北陸方面，新田義貞進(jìn)入金崎城，與本據(jù)地上野、越后聯(lián)絡(luò)開始活動(dòng)。重視事態(tài)的足利尊氏讓越前守護(hù)斯波高經(jīng)、若狹守護(hù)斯波家兼兄弟負(fù)責(zé)對(duì)付新田義貞，并派執(zhí)事高師直之弟高師泰作為后援。高師泰等在建武四年（1337年）三月，攻陷金崎城，尊良親王自殺，恒良親王被捕。斯波軍在此后與新田軍激戰(zhàn)。歷應(yīng)元年（1338年）閏七月的藤島之戰(zhàn)，新田義貞敗死。奧州方面，北畠顯家受到足利軍的猛攻不得不放棄多賀國府。建武四年（1337年）正月，轉(zhuǎn)移到伊達(dá)郡的靈山，由于后醍醐天皇的命令再度踏上西上之途。同年八月，帶領(lǐng)十萬精銳出發(fā)。十二月導(dǎo)致在鐮倉輔佐足利義詮的的斯波家長(zhǎng)敗死。歷應(yīng)元年（1338年）一月，到達(dá)美濃。于是足利尊氏派遣高師冬防御顯家軍，高師冬的軍勢(shì)在同國青野原大敗。北畠顯家軍自此南進(jìn)伊勢(shì)，經(jīng)伊賀向奈良進(jìn)發(fā)，準(zhǔn)備進(jìn)攻京都。對(duì)此足利方的高師直率大軍南下，二月，在般若坡?lián)羝票碑冿@家軍，連戰(zhàn)之末的五月，北畠顯家在和泉石津敗死。
北畠顯家、新田義貞的相繼陣亡，對(duì)于南朝方來說是極大的打擊。后醍醐天皇為了挽回頹勢(shì)，采用再次派遣皇子到各地的策略。同年九月，懷良親王作為征西大將軍下向西國，義良、宗良兩親王與北畠親房及其次子北畠顯信等下向東國。伊勢(shì)出航的義良親王一行，在途中遭遇暴風(fēng)雨，義良親王（后村上天皇）被吹回伊勢(shì)，宗良親王漂至遠(yuǎn)江國，只有北畠親房成功到達(dá)目的地常陸。進(jìn)入常陸的北畠親房為爭(zhēng)取南朝的據(jù)點(diǎn)而奮斗，不久由于關(guān)東執(zhí)事高師冬的東下逐漸受到壓迫。康永二年（1343年）十一月，北畠親房含恨返回吉野。自此之后，后醍醐天皇在歷應(yīng)二年（1339年）得病，八月十六日在吉野結(jié)束一生，義良親王即位，也就是后村上天皇。
足利尊氏接到后醍醐天皇駕崩的通知后，十分感慨，立刻停止幕府的雜務(wù)沙汰七天表示哀悼之意。同年冬，為了吊唁天皇的菩提，在洛西之地創(chuàng)建天龍寺。歷應(yīng)四年（1341年）七月同寺竣工之時(shí)，足利尊氏與足利直義一起出席，親自負(fù)責(zé)著土。
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