查找和下載數(shù)據(jù)
從GEO搜索關(guān)鍵字“(gastric cancer) AND "Homo sapiens"[porgn:__txid9606]”，得到胃癌相關(guān)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)。對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，過濾掉沒有重復(fù)試驗(yàn)的樣品。接下來，閱讀文獻(xiàn)，找出研究正常人和癌癥病人，或者癌組織與正常組織的比較的數(shù)據(jù)。下載這些數(shù)據(jù)的表達(dá)矩陣或CEL文件，用于后續(xù)的分析。
（本文分析為原創(chuàng)，轉(zhuǎn)載或引用文中圖片請(qǐng)聯(lián)系樓主，謝謝。數(shù)據(jù)請(qǐng)勿直接引用。）
表1 用于分析的數(shù)據(jù)
注：
Series 序列號(hào)
GEO GEO id
Platforms 芯片平臺(tái)號(hào)
Normal 正常樣品數(shù)目
Tumor 癌癥樣品數(shù)目
Reference 參考文獻(xiàn)
數(shù)據(jù)處理
對(duì)于芯片表達(dá)值數(shù)據(jù)，直接從GEO下載數(shù)據(jù)，對(duì)于沒有取log的值，進(jìn)行取log處理。對(duì)于CEL文件，使用affy包讀取CEL文件的表達(dá)量數(shù)據(jù)。在同一芯片內(nèi)，如果一個(gè)基因有多個(gè)探針，取所有探針的平均值作為基因的表達(dá)值。
差異表達(dá)
對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，我們使用limma進(jìn)行芯片之間的標(biāo)準(zhǔn)化，差異表達(dá)分析(每個(gè)實(shí)驗(yàn)的limma分析結(jié)果保存在01_limma里面)。
每個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做完limma分析之后，根據(jù)logFoldChange值對(duì)基因進(jìn)行排序，然后進(jìn)行Rank分析(adjust Pvalue<0.05，矯正方法為bonferroni矯正法)。Rank方法的零假設(shè)是每個(gè)基因在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)排序，如果某個(gè)基因在所有實(shí)驗(yàn)中，都排在前面，那么它的p值越小，是差異基因可能性越大。
通過Rank分析，我們共找到960個(gè)差異基因，其中458個(gè)上調(diào)基因，502個(gè)下調(diào)基因。
使用pheatmap繪制最上調(diào)和最下調(diào)的20個(gè)基因做熱圖，得到差異基因的熱圖。從圖中可以看出，上調(diào)的基因基本在所有實(shí)驗(yàn)中l(wèi)ogFC>0，而下調(diào)的基因基本在所有的實(shí)驗(yàn)中l(wèi)ogFC<0。
表2 差異基因列表
注：
Name gene symbol
logFC 每個(gè)實(shí)驗(yàn)差異logFC均值
Pvalue 統(tǒng)計(jì)學(xué)p值
adjPvalue 校正后的p值
圖1 logFC熱圖
橫坐標(biāo)是geo id，縱坐標(biāo)是基因名，紅色代表logFC>0，綠色代表logFC<0，方框里面的數(shù)值代表logFC值。
TCGA驗(yàn)證差異基因
從TCGA下載胃癌level3的RNA-seq數(shù)據(jù)，共xx個(gè)正常組織，xx個(gè)腫瘤組織。下載的數(shù)據(jù)是每個(gè)樣品單個(gè)的FPKM文件，我們使用perl語言將所有的樣品合并成一個(gè)矩陣，便于后續(xù)的分析。接下來，我們使用Wilcoxon tests非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫得到差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。
通過TCGA驗(yàn)證，我們共找到749個(gè)差異基因，其中320個(gè)上調(diào)基因，429個(gè)下調(diào)基因。
表3 TCGA驗(yàn)證差異基因
注：
Name gene symbol
logFC 每個(gè)實(shí)驗(yàn)差異logFC均值
Pvalue 統(tǒng)計(jì)學(xué)p值
adjPvalue 校正后的p值
生存分析
從TCGA下載生存數(shù)據(jù)，并將生存數(shù)據(jù)和差異基因表達(dá)數(shù)據(jù)整合在一起，做接下來的生存分析。使用survival R包進(jìn)行生存分析并繪制生存曲線，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)為log rank檢驗(yàn)，過濾條件為Pvalue<0.01。通過分析，共找到168個(gè)與胃癌生存相關(guān)的差異基因，結(jié)果保存在04_TCGAsurvival/survival.xlsx里面。168個(gè)生存相關(guān)基因的生存曲線保存在04_TCGAsurvival/picture目錄下。
圖2 生存分析
圖中，橫坐標(biāo)是生存時(shí)間，縱坐標(biāo)是
總生存率，紅色表達(dá)基因高表達(dá)組，藍(lán)色代表低表達(dá)組。
GO富集分析
使用DAVID對(duì)目標(biāo)靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，F(xiàn)DR<0.05被作為篩選條件，我們共找到5個(gè)相關(guān)的GO，（即“extracellular space”、“digestion”等），使用ggplot2 R包繪制GO富集柱狀圖。5個(gè)相關(guān)GO表格和GO富集柱狀圖保存在diffSig\GO\GO.xls目錄下。
圖5 GO富集結(jié)果
注：
Term 富集的GO
Count 差異基因落在Term的數(shù)目
PValue 富集統(tǒng)計(jì)學(xué)p值
FDR 統(tǒng)計(jì)FDR值(false discovery rate)
圖3 GO富集柱狀圖
橫坐標(biāo)是富集在GO的基因數(shù)目，縱坐標(biāo)是富集的GO。顏色代表富集的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，越藍(lán)表示富集程度越高。
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KEGG富集分析
使用KOBAS對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，Corrected P-Value<0.05被作為篩選條件。我們共找到23個(gè)相關(guān)的KEGG，富集的表格保存在diffSig\KEGG\KEGG.xlsx目錄下，最富集通路hsa04971圖保存在diffSig\KEGG\hsa04971.png目錄下。如果需要查看其它富集通路的通路圖，可以打開差異diffSig\KEGG\KEGG.xlsx，點(diǎn)擊相應(yīng)通路的Hyperlink鏈接即可。
表6 KEGG富集結(jié)果
注：
Term 富集的KEGG
ID KEGG ID
P-Value 富集統(tǒng)計(jì)學(xué)p值
Corrected P-Value 矯正后的p值
圖4 hsa04971通路圖
綠色代表通路中的基因，紅色代表我們輸入的生存相關(guān)基因。
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蛋白互作網(wǎng)絡(luò)
使用String軟件對(duì)生存相關(guān)基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，得到蛋白的相互作用關(guān)系。圖1是蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，圖中圓圈代表蛋白，連線蛋白蛋白之間存在互作關(guān)系。使用R軟件繪制互作網(wǎng)絡(luò)鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目圖，圖2是每個(gè)蛋白的鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目，鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目越多，說明該基因位于蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的核心，對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)起的作用最關(guān)鍵。由圖2可以看出，CFTR、SST、TIMP1等位于網(wǎng)絡(luò)的最核心。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖和互作網(wǎng)絡(luò)鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目圖、互作網(wǎng)絡(luò)鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)表格保存在diffSig\蛋白互作網(wǎng)絡(luò)目錄下。
圖5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖
圓圈代表基因，線條代表基因間存在蛋白相互作用，圓圈內(nèi)部的結(jié)果代表蛋白的結(jié)構(gòu)。線頭顏色代表證明蛋白之間存在相互作用的不同證據(jù)。(small nodes:protein of unknown 3D structure; large nodes: some 3D structure is known or predicted; A red line indicates the presence of fusion evidence ; a green line - neighborhood evidence; a blue line - coocurrence evidence; a purple line - experimental evidence; a yellow line – text mining evidence; a light blue line - database evidence; a black line - coexpression evidence.)
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