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大多數(shù)癌癥診斷技術(shù)依賴于令人不舒服和侵入性的程序，如組織活檢、內(nèi)窺鏡檢查或X光檢查。血液樣本檢測(cè)可能是一個(gè)相對(duì)更好的選擇，但目前也只有少數(shù)疾病可以通過血液檢測(cè)來診斷。

外泌體（exosome），是細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種囊泡型天然生物顆粒，其中攜帶了許多功能性生物分子，包括DNA、miRNA、mRNA、circRNA、lncRNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等，參與生理活動(dòng)和病理變化中的細(xì)胞間通訊。外泌體為了解其來源的細(xì)胞的生理狀態(tài)提供了一扇窗口，因?yàn)樗鼈償y帶的貨物在不同病理?xiàng)l件下有所不同，其中，異常的miRNA水平與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病相關(guān)。

近日，鄭州大學(xué)藥學(xué)院張開翔、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院高華等人在 ACS Sensors 期刊發(fā)表了題為：Highly Effective Detection of Exosomal miRNAs in Plasma Using Liposome-Mediated Transfection CRISPR/Cas13a 的研究論文。

該研究開發(fā)了一種脂質(zhì)體介導(dǎo)的膜融合CRISPR平臺(tái)——MFS-CRISPR，該平臺(tái)使用CRISPR-Cas13a來檢測(cè)血漿外泌體中微量的癌癥相關(guān)miRNAs，能夠檢測(cè)低至1.2× 103 particles/mL的外泌體miR-21，并有效區(qū)分惡性和良性樣本。

這項(xiàng)新技術(shù)在癌癥診斷和治療監(jiān)測(cè)方面具有很好的臨床潛力，該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏，有望推動(dòng)微創(chuàng)液體活檢技術(shù)的發(fā)展。

癌細(xì)胞獨(dú)特的胞內(nèi)環(huán)境可以通過miRNA等生物標(biāo)志物反映在其外泌體中。miRNA是一類由細(xì)胞的內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)控作用。

外泌體miRNA在癌癥生物學(xué)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可作為癌癥診斷的潛在生物標(biāo)志物。然而，外泌體中miRNA的水平非常低，因此，以一種易于操作的方式識(shí)別、檢測(cè)和量化疾病相關(guān)外泌體miRNA仍然存在挑戰(zhàn)。

此前，已有研究開發(fā)了基于CRISPR基因編輯的檢測(cè)系統(tǒng)來分析細(xì)胞外囊泡中的RNA和蛋白質(zhì)，例如用于檢測(cè)細(xì)胞外囊泡中SARS-CoV-2 RNA的CRISPR-Cas12a系統(tǒng)，以及檢測(cè)腫瘤細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡中蛋白質(zhì)的CRISPR-Cas12a系統(tǒng)。

在這項(xiàng)最新研究中，研究團(tuán)隊(duì)希望開發(fā)出一種新方法來檢測(cè)微量的癌癥相關(guān)外泌體miRNA，該檢測(cè)方法基于CRISPR-Cas13a系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有獨(dú)特的RNA酶活性，而而且靈敏、可靠和有效。研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一個(gè)CRISPR-Cas13a系統(tǒng)來切割熒光基團(tuán)和淬滅劑標(biāo)記的報(bào)告分子，然后將其包裝到脂質(zhì)體中，這一脂質(zhì)體相當(dāng)于人造版外泌體，使用脂質(zhì)體介導(dǎo)的膜融合（MFS）策略，將CRISPR-Cas13a系統(tǒng)轉(zhuǎn)染到外泌體中。

由于Cas13a具有獨(dú)特的RNA酶（RNase）活性，RNA引導(dǎo)下Cas13a的反式切割活性可以裂解熒光團(tuán)和淬滅劑標(biāo)記的報(bào)告細(xì)胞，導(dǎo)致靶標(biāo)RNA觸發(fā)RNA酶激活后熒光增強(qiáng)。

當(dāng)脂質(zhì)體和外泌體融合在一起時(shí)，如果外泌體中存在靶標(biāo)miRNA序列，CRISPR-Cas13a就會(huì)識(shí)別并結(jié)合到靶標(biāo)miRNA，然后激活反式切割活性，有效切割并產(chǎn)生放大的熒光信號(hào)。

MFS-CRISPR平臺(tái)的建立

在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)以miR-21為靶標(biāo)進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，miR-21是一種與包括乳腺癌在內(nèi)的幾種疾病相關(guān)的miRNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MFS-CRISPR技術(shù)平臺(tái)可以成功地在類似序列的混合物中檢測(cè)到miR-21，并且具有高靈敏度。研究團(tuán)隊(duì)還在一組來自健康人類細(xì)胞的外泌體和來自乳腺癌細(xì)胞的外泌體上測(cè)試了該方法，該方法能夠?qū)┌Y相關(guān)的外泌體與健康細(xì)胞來源的外泌體區(qū)分開來，這表明該平臺(tái)可用于癌癥診斷。

MFS-CRISPR平臺(tái)有以下優(yōu)點(diǎn)：1）使用脂質(zhì)體介導(dǎo)的膜融合策略，可以將CRISPR-Cas13a與外泌體融合，直接測(cè)量血漿中外泌體miRNA，避免了耗時(shí)的提取步驟；2）使用CRISPR-Cas13a熒光信號(hào)放大方法，顯著提高檢測(cè)靈敏性；3）MFS-CRISPR平臺(tái)無需提取RNA，避免了RNA降解和污染的發(fā)生。

研究團(tuán)隊(duì)表示，基于CRISPR-Cas13a的MFS-CRISPR平臺(tái)，可以直接檢測(cè)血液樣本并成功區(qū)分來自乳腺癌患者和健康捐贈(zèng)者的臨床樣本，從臨床樣本熒光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果來看，乳腺癌患者與健康捐贈(zèng)者的miR-21表達(dá)差異顯著。因此，通過MFS-CRISPR平臺(tái)檢測(cè)分析血液樣本，有望實(shí)現(xiàn)更快、更簡(jiǎn)便的癌癥診斷和監(jiān)測(cè)。