環(huán)狀RNA（circRNA）是一種新興的內(nèi)源性非編碼RNA（ncRNA），它們參與細(xì)胞增殖、粘附、凋亡和存活等多個生物學(xué)過程[1]。
近年來，circRNAs在腫瘤領(lǐng)域也獲得了越來越多的關(guān)注。有研究表明許多circRNA能促進(jìn)細(xì)胞周期發(fā)展，抑制或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及抑制血管生成等等[2]，各種不同的circRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著不同甚至相反的作用。
雖然越來越多的研究報道了乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌中異常的circRNAs[3]，但circRNAs在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能、分子機制和環(huán)狀模式尚不清楚。此外，還有研究提出circRNAs可以通過病理功能未知的外泌體分泌到循環(huán)中[4]，且比線性RNAs更容易被分選進(jìn)入外泌體。然而，circRNAs的外泌體特異性分選機制也仍然完全未知。
近日，來自浙江大學(xué)張紅河和中國藥科大學(xué)來茂德領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊，闡明了circRHOBTB3在結(jié)直腸癌（CRC）進(jìn)展中的生物學(xué)作用、環(huán)化過程和分泌途徑，這一結(jié)果發(fā)表在Molecular Cancer期刊上。
他們發(fā)現(xiàn)，抑瘤circRHOBTB3通過外泌體被癌細(xì)胞排出，以維持結(jié)直腸癌細(xì)胞的活性。此外，他們還設(shè)計了靶向circRHOBTB3的環(huán)狀化和分泌元件的反義寡核苷酸（ASOs），用于CRC的治療。
論文首頁截圖
circRHOBTB3是宿主基因RHOBTB3轉(zhuǎn)錄后剪接和環(huán)狀化而產(chǎn)生的一種circRNA。RHOBTB3作為Rho GTPase家族ATP酶，參與膜轉(zhuǎn)運[5、6]和蛋白酶體降解[7]。
先前的研究也表明circRHOBTB3在CRC、卵巢癌、胃癌和肝細(xì)胞癌（HCC）中作為腫瘤抑制circRNA。然而，它的循環(huán)模式和外泌體分泌途徑并未被闡釋。
首先，研究人員分析了來自GEO數(shù)據(jù)庫的12例CRC患者、21例HCC患者、32例胰腺腺癌（PAAD）患者和14例健康供體的血清外泌體的總RNA-seq數(shù)據(jù)。
結(jié)果顯示，許多circRNAs在腫瘤患者血清外泌體中的表達(dá)程度不同（圖1A），但在所有三種癌癥來源的外泌體中，只有hsa_circ_0007444（circRHOBTB3）均表達(dá)上調(diào)（圖1B），且其宿主基因RHOBTB3在三種腫瘤組織中的表達(dá)與正常組織相比均無顯著性的增強（圖1C）。
圖1 不同類型癌癥中ircRHOBTB3在患者血清外泌體中的表達(dá)情況
然而，對來自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院邵逸夫醫(yī)院體檢的18例CRC患者和16例健康供者的血清樣本數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與健康供者相比，circRHOBTB3在CRC組織中顯著下調(diào)，而宿主基因RHOBTB3顯著上調(diào)（圖2左二）。而且，在69個CRC組織樣本中檢測到的circRHOBTB3的表達(dá)結(jié)果顯示，circRHOBTB3水平較高患者的總生存期更好（圖2右一）。
圖2 ircRHOBTB3在CRC組織中患者血清外泌體中的表達(dá)情況
于是，研究者不禁假設(shè)，circRHOBTB3是否具有抑癌作用？
為了驗證這一點，他們先確定了CRC患者血清外泌體中的circRHOBTB3確實來源于腫瘤細(xì)胞而非基質(zhì)細(xì)胞（圖3A），且circRHOBTB3水平在來自NCM460細(xì)胞（正常的腸上皮細(xì)胞系）的外泌體中最低（圖3B）。進(jìn)一步在RKO、HCT116細(xì)胞（CRC細(xì)胞系）中過表達(dá)或敲低circRHOBTB3，結(jié)果表明circRHOBTB3可以抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力（圖3C）。
圖3 circRHOBTB3來源與功能的體外驗證實驗
并且，他們通過對circRHOBTB3敲除/重新表達(dá)細(xì)胞系RNA-Seq數(shù)據(jù)的分析，以及RT-qPCR驗證發(fā)現(xiàn)，在circRHOBTB3敲除的細(xì)胞系中代謝、增殖和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）通路相關(guān)基因顯著上調(diào)，而circRHOBTB3的重新表達(dá)降低了這些基因的表達(dá)。此外，circRHOBTB3敲除的細(xì)胞系中ROS水平也顯著升高。
他們還發(fā)現(xiàn)circRHOBTB3的結(jié)合蛋白是ENO1和ENO2。也就是說，circRHOBTB3可能通過與ENO1和ENO2等代謝酶相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和EMT。
為了驗證circRHOBTB3在體內(nèi)的功能，研究人員將過表達(dá)circRHOBTB3的HCT116細(xì)胞（CRC細(xì)胞系）皮下注射到裸鼠體內(nèi)，構(gòu)建了異種移植瘤模型。研究發(fā)現(xiàn)，與不表達(dá)circRHOBTB3的對照（EV）組相比，circRHOBTB3過表達(dá)（circRHOBTB3-OE）組的腫瘤體積和重量都顯著更小，且細(xì)胞增殖能力也更弱（圖4A、B、C）。
而當(dāng)他們在裸鼠脾臟接種實驗中觀察肝轉(zhuǎn)移表型時發(fā)現(xiàn)，circRHOBTB3-OE組肝轉(zhuǎn)移灶少于EV組（圖4D、E）。更為有趣的是，circRHOBTB3可以在異種移植瘤小鼠模型的血漿和尿液中檢測到，而在野生型小鼠的血漿和尿液中則沒有。此外，circRHOBTB3-OE組的血漿中circRHOBTB3的水平高于EV組（圖4F、G）。
圖4 circRHOBTB3功能的體內(nèi)驗證實驗
根據(jù)這些數(shù)據(jù)，研究者們推測CRC細(xì)胞必須通過外泌體分泌抑制腫瘤的circRHOBTB3來維持腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的特征，換言之，CRC細(xì)胞有特殊的“排毒”機制。
在隨后的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)了circRHOBTB3的環(huán)化機制，還發(fā)現(xiàn)circRHOBTB3本身的順式元件（141–240nt，141-165nt，216-240nt）可以調(diào)節(jié)circRHOBTB3通過外泌體的分泌過程（圖5）。
圖5 轉(zhuǎn)染了截斷的circRHOBTB3載體的細(xì)胞中circRHOBTB3外泌體分泌豐度
之前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，ESCRT-II亞復(fù)合物作為一種RNA結(jié)合復(fù)合物，可以將RNA分選至外泌體[8]中。在該文研究中，他們發(fā)現(xiàn)SNF8可以結(jié)合到circRHOBTB3的141-240nt區(qū)域，促進(jìn)circRHOBTB3被分選至外泌體并分泌到胞外。他們將這個過程被定義為“腫瘤外泌體逃逸機制”（圖6）。
圖6 SNF8敲低實驗以及外源的RIP實驗
受上述研究結(jié)果啟發(fā)，研究人員設(shè)計了二代ASOs，以增加circRHOBTB3的環(huán)化并減少分泌，這有望成為一種新的癌癥治療策略。
研究人員設(shè)計了三種二代ASOs：一個靶向負(fù)環(huán)化的元件（ASO-cir：266-290nt）和兩個外泌體分泌的元件（ASO-exo1：141-165nt，ASO-exo2：216-240nt）（圖7）。
通過實驗他們發(fā)現(xiàn)，ASO-cir確實能增加circRHOBTB3的環(huán)化，但circRHOBTB3的分泌卻會同時增加；而ASO-exo1和ASO-exo2中，僅ASO-exo2（以下簡稱ASO-exo）既增加circRHOBTB3的胞內(nèi)水平，又阻斷circRHOBTB3外泌體的分泌。因此，研究者們考慮進(jìn)一步使用ASO-cir和ASO-exo，研究二者聯(lián)合治療對結(jié)直腸癌的特異性和抗腫瘤效果。
圖7 二代ASOs及其作用機制
研究人員驗證了ASOs的聯(lián)合用藥的確比ASO-cir和ASO-exo的單獨用藥能產(chǎn)生更多的胞內(nèi)circRHOBTB3，且小鼠實驗的結(jié)果符合預(yù)期：ASO-cir聯(lián)合ASO-exo確實顯著提高了脾臟原發(fā)病灶中circRHOBTB3的表達(dá)，還可顯著減少腫瘤惡病質(zhì)，且能控制轉(zhuǎn)移（圖8）。
圖8 ASOs體外及體內(nèi)實驗
總的來說，這項研究成果闡明了circRHOBTB3調(diào)節(jié)細(xì)胞間ROS和代謝途徑來抑制CRC的進(jìn)展的機制，還且提出了一種新的腫瘤逃逸理論，即腫瘤細(xì)胞通過“排泄”腫瘤抑制circRNA來維持癌細(xì)胞的活性（“腫瘤外泌體逃逸機制”）。
更重要的是，他們設(shè)計的二代ASOs可以通過靶向環(huán)化和分泌來調(diào)控腫瘤抑制circRNA，以此促進(jìn)癌癥的治療效果。且他們的臨床數(shù)據(jù)顯示，在CRC患者中，85.7%（30/35）的腫瘤樣本攜帶的circRHOBTB3水平低于配對的正常樣本，而腫瘤樣本中circRHOBTB3的低表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān)。這讓我們更加相信，這種ASOs將成為未來針對CRC的一種有前途的治療策略。
