2022年3月29日 理化研究所 京都大學(xué)iPS細(xì)胞研究所 京都大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)研究科 人iPS細(xì)胞直接誘導(dǎo)視細(xì)胞的方法-可以迅速簡便地分化誘導(dǎo)視細(xì)胞-
理化學(xué)研究所(理研)生物資源研究中心iPS制藥基礎(chǔ)開發(fā)小組大冢悠生研修生(京都大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)研究科眼科學(xué)講座研究生)、今村惠子客座研究員(京都大學(xué)iPS細(xì)胞研究所特定據(jù)點(diǎn)講師)、井上治久小組組長(京都大學(xué)iPS細(xì)胞研究所教授)、 京都大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)研究科眼科學(xué)講座辻川明孝教授等人的聯(lián)合研究小組發(fā)現(xiàn)，通過表達(dá)特定的轉(zhuǎn)錄因子[1]，可以在短時間內(nèi)從人工多能干細(xì)胞( iPS細(xì)胞) [2]分化誘導(dǎo)視網(wǎng)膜的構(gòu)成細(xì)胞視細(xì)胞[3]。 本研究成果有望為以視網(wǎng)膜變性疾病[4]為首的視細(xì)胞相關(guān)研究的疾病建模和治療藥物的探索做出貢獻(xiàn)。 迄今為止，雖然進(jìn)行了從iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)構(gòu)成視網(wǎng)膜的細(xì)胞的研究，但是需要花費(fèi)時間，需要經(jīng)過多個步驟成為了課題。 此次，聯(lián)合研究小組通過向人iPS細(xì)胞導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子CRX和NEUROD1并使其暫時性地過度表達(dá)，構(gòu)建了比以往的分化誘導(dǎo)方法更短時間、更進(jìn)一步地在視細(xì)胞表達(dá)特異性基因的誘導(dǎo)型視細(xì)胞樣細(xì)胞(以下稱為誘導(dǎo)視細(xì)胞)的方法 通過單細(xì)胞RNA分析[5]，分析誘導(dǎo)視細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄子[6]，發(fā)現(xiàn)表達(dá)了各種光傳遞相關(guān)基因。 制造的誘導(dǎo)視細(xì)胞在鈣成像[7]中顯示了其功能特性。 此外，在使用誘導(dǎo)視細(xì)胞的光傷害模型[8]中，光誘導(dǎo)性細(xì)胞死亡受到了抗氧化物質(zhì)的給藥的抑制。 本研究于3月8日刊登在在線科學(xué)雜志《iScience》上。
由人iPS細(xì)胞制備誘導(dǎo)視細(xì)胞的方法示意圖 背景
在眼球內(nèi)感受光的視網(wǎng)膜中，視細(xì)胞是感受光的主要組成細(xì)胞。 視網(wǎng)膜變性疾病是視細(xì)胞變性的進(jìn)行性疾病群，會引起不可逆的視力下降。 視網(wǎng)膜變性疾病有很多病例病情不明，根本的治療方法還不存在。
在研究這些疾病時，iPS細(xì)胞技術(shù)對視細(xì)胞的產(chǎn)生、試管內(nèi)疾病模型的制作都很有用。 到目前為止，已經(jīng)報道了幾種制造視細(xì)胞的分化誘導(dǎo)法。 另外，近年來，關(guān)于誘導(dǎo)具有與生物體相近結(jié)構(gòu)的三維視網(wǎng)膜有機(jī)化合物[9]的研究也在進(jìn)行。 但是在這些方法中，存在為了制作視細(xì)胞需要長時間的培養(yǎng)和多個步驟的課題。 圖1人iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的視細(xì)胞免疫染色圖譜 左)由導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子CRX和NEUROD1的人iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)后，第28天細(xì)胞用特異性標(biāo)記(綠色)染色成視細(xì)胞的圖像。 標(biāo)尺為50微米( μm，1μm為千分之一毫米)。
右)左圖虛線包圍的部分放大后的內(nèi)容。 可見特征細(xì)長形態(tài)誘導(dǎo)的細(xì)胞。 比例尺為50μm。 另外，進(jìn)行單細(xì)胞RNA分析，詳細(xì)調(diào)查誘導(dǎo)視細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄子，發(fā)現(xiàn)與視細(xì)胞發(fā)生相關(guān)的各種基因和與光信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因被激活了很多。 因此，為了調(diào)查誘導(dǎo)視細(xì)胞實際上是否保持了功能特性，給予了可以模仿光刺激的試劑(膜透過性cGMP模擬)，并通過鈣成像觀察了其響應(yīng)。 結(jié)果表明，誘導(dǎo)視細(xì)胞對該試劑有反應(yīng)，特別是在一些細(xì)胞中，會發(fā)生距基線30%以上的大變化(圖2 )。
這些結(jié)果表明，與傳統(tǒng)方法相比，在分化開始后28天的短時間內(nèi)，能夠制備表達(dá)視細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)組的功能性細(xì)胞。 圖3光傷害模型示意圖
對培養(yǎng)28天的誘導(dǎo)視細(xì)胞照射白色LED光24小時后，表達(dá)視紫紅質(zhì)的細(xì)胞(綠)數(shù)量比在暗處培養(yǎng)的細(xì)胞減少。 今后的期待
本研究表明，直接誘導(dǎo)法應(yīng)用于人iPS細(xì)胞的視細(xì)胞誘導(dǎo)，比傳統(tǒng)的分化誘導(dǎo)法更快地制備人的視細(xì)胞。
今后，通過研究能夠更高效地制作視細(xì)胞的培養(yǎng)條件，結(jié)合目的細(xì)胞篩選的純化方法，有望建立利用誘導(dǎo)視細(xì)胞的視網(wǎng)膜變性疾病的疾病模型和探索治療藥物。 補(bǔ)充說明
1 .轉(zhuǎn)錄因子
參與促進(jìn)或抑制寫入基因( DNA )的遺傳信息向RNA轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)組。 已鑒定出約2，000多種蛋白質(zhì)。
2 .人工多能干細(xì)胞( iPS細(xì)胞)
脊椎動物的初期胚胎等具有的分化為所有種類的體細(xì)胞的能力被稱為多能性。 具有多能性，可以在試管內(nèi)培養(yǎng)無限增加的細(xì)胞叫做多能干細(xì)胞。 iPS細(xì)胞是向成人血液和皮膚細(xì)胞中導(dǎo)入Oct3、Sox2、Klf4基因等人工制作的具有多能性的干細(xì)胞。
3 .視細(xì)胞
是構(gòu)成視網(wǎng)膜的細(xì)胞之一，承擔(dān)著接受光并將光信號傳遞到視網(wǎng)膜內(nèi)其他神經(jīng)細(xì)胞的重要作用。 視細(xì)胞大致可分為錐體視細(xì)胞和桿體視細(xì)胞兩種。 錐體視細(xì)胞用于明亮的地方，桿體視細(xì)胞用于黑暗的地方看東西的時候。
4 .視網(wǎng)膜變性疾病
這是一種嚴(yán)重的疾病，導(dǎo)致包括失明在內(nèi)的強(qiáng)度視力障礙，在構(gòu)成視網(wǎng)膜的細(xì)胞中，作為光受體的視細(xì)胞因年齡增加和遺傳原因等而變性脫落。 代表性的有視網(wǎng)膜色素變性。
5 .單胞RNA分析
使用新一代可編程控制器，從質(zhì)和量上全面調(diào)查各個細(xì)胞保持的整個mRNA的方法。 結(jié)合維度壓縮等數(shù)學(xué)分析，可以根據(jù)基因表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行細(xì)胞分類，可以鑒定傳統(tǒng)組織學(xué)或細(xì)胞生物學(xué)方法無法知曉的新細(xì)胞種類和推測細(xì)胞狀態(tài)。
6 .轉(zhuǎn)錄子
細(xì)胞中存在的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(編碼蛋白質(zhì)的mRNA、不編碼蛋白質(zhì)的非編碼RNA、微RNA等)的總體。 轉(zhuǎn)錄因子與基因組不同，無論是同一個體還是每個組織，甚至根據(jù)發(fā)生階段、細(xì)胞外環(huán)境、刺激而變化。
7 .鈣成像
一種測定細(xì)胞中鈣離子流動，直接觀察活動中細(xì)胞中鈣離子濃度變化的方法。 在腦細(xì)胞的研究等中被廣泛利用。
8 .光傷害模型
老鼠等動物模型，以及由視網(wǎng)膜建立的株化細(xì)胞，如果持續(xù)照射一定光量的光，就會發(fā)生細(xì)胞死亡。 在此基礎(chǔ)上進(jìn)行視網(wǎng)膜變性疾病病情調(diào)查和治療藥物探索的方法。
9 .有機(jī)化合物
試管中由干細(xì)胞制造的微型器官。 利用干細(xì)胞的自我復(fù)制能力和分化能力，通過自我組織形成三維的組織樣結(jié)構(gòu)。
研究支援
