通過基因組編輯來糾正異常，這個概念似乎簡單明了。幾十年來，科學家也一直嘗試用基因編輯來開展治療，獲得了不同程度的成功。最大的障礙來自基因?qū)胂到y(tǒng)，它往往使用病毒，具有一定的風險。
2013年，研究人員首次利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)來編輯哺乳動物細胞的基因組，對編輯發(fā)生的位置有了很好的控制1。從那時起，人們不斷提高此系統(tǒng)的效率，創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型，并糾正許多遺傳疾病。體外和體內(nèi)的結(jié)果都預示著臨床上的成功。然而，斯坦福大學的一項新研究給人們潑了一盆冷水，因為人們對Cas9蛋白存在免疫力2。
CRISPR的過去
許多發(fā)明都是無心插柳柳成蔭，CRISPR-Cas9也不例外。1989年，研究生Francisco Mojica出于好奇，發(fā)現(xiàn)耐鹽微生物（Haloferax mediterranei）基因組中存在回文重復序列3。這種規(guī)律間隔的重復序列不同于任何已知的重復序列家族。
很快，研究人員在更多的微生物中鑒定出這些結(jié)構(gòu)，并將其稱之為CRISPR（規(guī)律間隔的短回文重復序列）。在噬菌體基因組中觀察到重復序列之后，他們提出CRISPR可能有助于微生物抵御噬菌體。2007年，科學家Rodolphe Barrangou和Philippe Horvath發(fā)現(xiàn)這是真的。
Barrangou和Horvath的研究表明，細菌基因組容納部分的噬菌體基因組來作為防御機制，以阻止噬菌體對嗜熱鏈球菌的進一步攻擊4。接下來，研究人員一步步闡明CRISPR-Cas9如何在微生物免疫中發(fā)揮作用。CRISPR序列基本上來自入侵的噬菌體，保留了對攻擊者的記憶。CRISPR序列之后轉(zhuǎn)錄稱短的向?qū)NA（gRNA），而gRNA將Cas9核酸酶引導至匹配的噬菌體DNA上。Cas9切割外源DNA，使其失活。
2013年發(fā)表的CRISPR-Cas9成果為體外和體內(nèi)操作基因組引入了一種新方法，激發(fā)了人們利用基因療法來治愈疾病的熱情?；虔煼ㄒ呀?jīng)出現(xiàn)了很多年，但由于靶向基因?qū)牒退拗髅庖叻磻姆N種問題，一直難以實現(xiàn)人們的期望。CRISPR-Cas9有望解決大部分問題，但仍不清楚它在臨床上是否有效。
CRISPR的現(xiàn)在
人體的免疫系統(tǒng)相當復雜，盡管開展了大量研究，但研究人員仍然無法準確預測人體對外來或自身抗原、細胞或微生物的免疫反應。一次又一次的治療失敗，免疫系統(tǒng)都是背后主因：移植物抗宿主病、細胞的免疫排斥，病毒載體的嚴重免疫反應。因此，帶有抗體的患者必須被排除在臨床試驗之外，以避免不良免疫反應，甚至死亡。
斯坦福大學的Matthew Porteus對CRISPR-Cas9在人體中是否可行感到很好奇，因為常用的Cas9蛋白來自金黃色葡萄球菌（S. aureus）和化膿性鏈球菌（S. pyogenes），對人類來說是病原體。人類似乎擁有針對這些病原體的免疫力?！皼]有人開展這方面的研究，因此我們決定自己來。我們想看看健康的成年人是否有識別Cas9的抗體?！?/p>
一開始，Porteus的團隊并沒有料到會檢測到免疫反應，因為葡萄球菌和鏈球菌的多個抗原都在表面，而Cas9是細胞內(nèi)的蛋白。他們采集成年人血液和臍帶血，將其與2種不同的Cas9蛋白混合，并評估抗體的存在。
結(jié)果讓研究人員十分意外。“事實上，70%的健康成年人都攜帶了兩種Cas9的抗體。這讓我們大開眼界。然后我們想，抗體屬于適應性免疫反應的一部分，那么T細胞又將如何？”Porteus回憶道。
為了研究Cas9蛋白是否會刺激血液中不成熟的T細胞發(fā)展為輔助性或殺傷性T細胞，研究人員將含有不成熟T細胞的血液與Cas9蛋白混合。新生兒的免疫系統(tǒng)無法產(chǎn)生免疫反應，但金黃色葡萄球菌的Cas9會誘導成年人血液中的T細胞反應。Porteus認為，這個結(jié)果為基因治療試驗拋出了一個危險信號，因為Cas9的使用有可能在臨床背景下造成嚴重的炎癥反應和組織死亡。
CRISPR的未來
“現(xiàn)在還為時尚早，”Porteus說。“我們并不認為這意味著這項技術(shù)的熱度會下降，但我們的確認為，它提出了一個值得考慮的問題?！?/p>
在這種情況下，像以往的臨床試驗那樣排除有免疫力的患者是不可行的，Porteus預計大多數(shù)群體對Cas9蛋白都存在免疫力。不過，研究人員肯定不會放棄研究工作，力爭開發(fā)出在臨床上有效的基因療法。
“我認為人們將會做幾件事：1) 從不感染人類的其他細菌中獲得Cas9系統(tǒng)，2) 研究對金黃色葡萄球菌的免疫反應何時發(fā)生，因為此系統(tǒng)適用于兒童，3) 確定蛋白的哪些區(qū)域是免疫原性的，”Porteus說?！拔艺J為這是可行的，但也是頗具挑戰(zhàn)性的。人體的免疫系統(tǒng)相當盡職。”
Porteus希望，這項工作能夠鼓勵研究人員在考慮技術(shù)有效性的同時，考慮免疫反應?！叭梭w的免疫反應一直為基因治療帶來問題，我認為基因組編輯領(lǐng)域也有必要了解這一點。更好地了解它，將幫助人們找出解決方案，”Porteus說。
參考文獻
1. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., et al. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819–823.
2. Charlesworth CT, Deshpande PS, Dever PD, Dejene B, Gomez-Ospina N, Mantri S, Pavel-Dinu M, Camarena J, Weinberg KI and Porteus MH. (2018). Identification of pre-exisiting adaptive immunity to Cas9 proteins in humans. bioRxiv.
3. Mojica, F.J.M., Juez, G., and Rodr?′guez-Valera, F. (1993). Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites. Mol. Microbiol. 9, 613–621.
4. Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D.A., and Horvath, P. (2007). CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 315, 1709–1712.
