大家好，感謝大家多年以來的陪伴。在此，小編祝大家新年快樂，虎年大吉。Outline：
1. 蛋白偶聯(lián)與標(biāo)記方法（化學(xué)偶聯(lián)、酶法偶聯(lián)）
2. 蛋白鄰近標(biāo)記方法
3. 應(yīng)用
4. 拓展
1. 蛋白偶聯(lián)與標(biāo)記方法
賴氨酸Lys側(cè)鏈帶有氨基，由于其親核性、高溶劑暴露性和蛋白中較高的豐度，是天然蛋白修飾中研究最多的氨基酸之一，多種FDA批準(zhǔn)的ADC藥物都是利用Lys殘基作為生物偶聯(lián)位點(diǎn)來連接warheads。經(jīng)典伯胺生物偶聯(lián)通常是利用親電試劑，例如針對(duì)Lys的NHS酯，但是它們?cè)谥行跃彌_液中易于水解以及與其他親核氨基酸殘基的潛在副反應(yīng)，限制了其應(yīng)用。因此，開發(fā)高效、高化學(xué)選擇性的Lys生物偶聯(lián)方法具有重大意義。
阿扎菲酮是一種獨(dú)特的真菌多酮代謝物，其特征是具有多個(gè)氧的吡喃醌雙環(huán)核心。阿扎菲酮能在溫和的生理?xiàng)l件下與伯胺發(fā)生反應(yīng)，生成相應(yīng)的乙烯-γ-吡啶酮（vinylogous γ-pyridones, vPDNs）motif，是一些天然產(chǎn)物的來源（例如( )- isochromophilone VI和rubropunctatin）。這個(gè)反應(yīng)在溶液條件下的副產(chǎn)物只有水，非常適用于生理環(huán)境。利用這一反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)賴氨酸的快速偶聯(lián)。阿扎菲酮只要30 min就能快速完成對(duì)Lys的標(biāo)記，且?guī)缀醪缓推渌被岱磻?yīng)。與傳統(tǒng)的NHS活化酯相比，阿扎菲酮具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性【Angew. Chem. Int. Ed. | 阿扎菲酮用作伯胺特異性生物偶聯(lián)試劑】。
另外，通過肼與羰基的快速反應(yīng)能夠設(shè)計(jì)得到一種新的彈頭RMR1，通過形成的亞胺與本身帶有的酰胺分子結(jié)合硼中心原子穩(wěn)定產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。與賴氨酸的α-N形成共價(jià)結(jié)合將打破結(jié)構(gòu)的平面性并減弱共軛，使得RMR1對(duì)賴氨酸的ε-N具有高選擇性。并且可以通過形成亞胺-硼酸彈頭以調(diào)節(jié)鍵解離的動(dòng)力學(xué)過程，從而幫助設(shè)計(jì)合成長效可逆共價(jià)抑制劑【J. Am. Chem. Soc. | 具有長保留時(shí)間的賴氨酸靶向性可逆共價(jià)抑制劑】
對(duì)生物分子進(jìn)行位點(diǎn)選擇性的化學(xué)修飾在生命科學(xué)和藥物開發(fā)中非常重要，其中半胱氨酸Cys作為修飾位點(diǎn)具有親和性強(qiáng)、總體豐度低（因此容易實(shí)現(xiàn)單位點(diǎn)功能化）等優(yōu)點(diǎn)，目前Cys標(biāo)記中應(yīng)用最廣泛的是Michael加成受體馬來酰亞胺。但該結(jié)構(gòu)在存在其他硫醇分子或者還原環(huán)境中較不穩(wěn)定。除了單位點(diǎn)的Cys化學(xué)修飾，雙反應(yīng)位點(diǎn)的Cys試劑也應(yīng)用廣泛，其主要應(yīng)用于抗體的功能化，用于提升抗體的熱穩(wěn)定性。不飽和磷酰胺和硫代磷酸酯作為親電試劑，能夠用來標(biāo)記Cys，產(chǎn)生高度穩(wěn)定的共軛結(jié)構(gòu)?；谶@種穩(wěn)定Cys標(biāo)記方法，能夠拓展出一種雙位點(diǎn)的Cys標(biāo)記試劑，并將其用于二硫鍵的重構(gòu)?！?a target="_blank" >Angew. Chem. Int. Ed. | 用于半胱氨酸標(biāo)記和二硫鍵重構(gòu)的二乙炔基磷酸酯】一文中，發(fā)展了基于二乙炔磷酸酯的蛋白質(zhì)Cys選擇性標(biāo)記試劑和二硫鍵重構(gòu)的新方法，并在單抗上實(shí)現(xiàn)了對(duì)抗體的重構(gòu)和功能化。配體導(dǎo)向性偶聯(lián)試劑能夠進(jìn)一步增強(qiáng)偶聯(lián)的位點(diǎn)選擇性。正如【J. Am. Chem. Soc. | 用CoLDR化學(xué)實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源性蛋白的位點(diǎn)特異性標(biāo)記】中所提到，作者基于酪氨酸激酶BTK的一種抑制劑設(shè)計(jì)了Ibrutinib探針以靶向BTK活性位點(diǎn)，并進(jìn)而共價(jià)連接活性位點(diǎn)周圍的活性半胱氨酸，從而實(shí)現(xiàn)了炔基或其它熒光基團(tuán)的引入，并跟蹤了BTK蛋白在體內(nèi)自然降解的過程，同時(shí)篩選了一批可以耐受體內(nèi)固有谷胱甘肽的探針分子。作者進(jìn)一步使用這種共價(jià)配體定向釋放（covalent ligand directed release, CoLDR）位點(diǎn)特異性標(biāo)記策略，通過非遺傳學(xué)手段實(shí)現(xiàn)了對(duì)K-RasG12C系列和SARS-CoV-2 PLpro的特異性標(biāo)記，理論上能夠拓展到其它活性口袋附近存在活性半胱氨酸的蛋白上。
研究者們已經(jīng)對(duì)半胱氨酸、賴氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和甲硫氨酸等氨基酸進(jìn)行了一定程度的功能解析，而對(duì)酪氨酸殘基的全局性解析才剛剛起步。酪氨酸在蛋白質(zhì)中豐度較低，且由于苯酚具有兩親性，所以也會(huì)有一部分酪氨酸暴露在蛋白表面。這些酪氨酸參與到蛋白質(zhì)磷酸化修飾，酶底物之間的結(jié)合以及蛋白-蛋白相互作用中，所以對(duì)酪氨酸殘基的動(dòng)態(tài)調(diào)控對(duì)于研究蛋白活性，調(diào)節(jié)蛋白功能具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，一種穩(wěn)定的氧化亞胺自由基試劑能夠用于酪氨酸的可逆偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)上共價(jià)鍵的動(dòng)態(tài)調(diào)控。這種偶聯(lián)產(chǎn)物不穩(wěn)定會(huì)緩慢地發(fā)生脫除，且脫除效率與肟試劑的O-H鍵解離能相關(guān)，加入青霉胺或光照可以進(jìn)一步加速去偶聯(lián)反應(yīng)的速率，偶聯(lián)脫除后蛋白的活性和結(jié)合能夠很好的恢復(fù)【J. Am. Chem. Soc. | 利用氧化亞胺自由基實(shí)現(xiàn)蛋白中酪氨酸的可控標(biāo)記】。
苯惡嗪衍生分子作為多功能的偶聯(lián)試劑與酪氨酸側(cè)鏈反應(yīng)，既可以進(jìn)行內(nèi)源性蛋白質(zhì)標(biāo)記，也可以在此后應(yīng)用于生物正交合成。研究者設(shè)計(jì)了10氫-吩惡嗪-3,7-二甲醛，含有的芳香醛結(jié)構(gòu)，在生物相容性條件下，可以與多種分子發(fā)生低效縮合。并且，該結(jié)構(gòu)會(huì)延伸苯惡嗪π-共軛作用，可以使任何修飾的蛋白質(zhì)加合物產(chǎn)生熒光。通過這種苯惡嗪雙醛設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了活性蛋白酪氨酸選擇行化學(xué)官能團(tuán)偶聯(lián)方法的開發(fā)。可以在水溶液中溫和條件下將苯惡嗪二醛選擇性地偶聯(lián)到多種天然蛋白質(zhì)的特定酪氨酸殘基上。該方法極高的化學(xué)選擇特性，從一個(gè)復(fù)雜蛋白質(zhì)上的26個(gè)酪氨酸殘基中選擇標(biāo)記一個(gè)酪氨酸的能力，具有非常廣泛的應(yīng)用前景【Nat. Chem. |光催化的酪氨酸位點(diǎn)選擇性生物結(jié)合用于天然蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化】。S-氰化肽的肼解為天然化學(xué)連接（NCL）提供了關(guān)鍵基團(tuán)——酰肼，該方式無需任何內(nèi)含肽或Sortase A酶的幫助。然而目前使用的非選擇性S-氰基化方法對(duì)于蛋白質(zhì)中多個(gè)半胱氨酸具有一定的局限性。【Angew. Chem. Int. Ed. | C端四半胱氨酸標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)的蛋白質(zhì)連接與標(biāo)記】一文中提到一種區(qū)域選擇性氰基化和無痕肼解策略：在感興趣蛋白的C 末端融合四半胱氨酸標(biāo)簽——CCPGCC，該標(biāo)簽可以被雙砷化合物（FlASH-EDT2）高度選擇性地靶向并被其保護(hù)，進(jìn)一步將 2-溴苯乙酮 (PacBr) 添加到反應(yīng)混合物中以對(duì)剩余的 Cys 進(jìn)行正交保護(hù)，該部分將一直保留到肼解或 NCL 之后。然后加入過量的二硫醇試劑 EDT以在幾分鐘內(nèi)將FlASH-EDT2 從四半胱氨酸標(biāo)簽脫除。接下來，作者即可通過簡便的 NTCB對(duì)四半胱氨酸標(biāo)簽上的巰基進(jìn)行特異性的氰基化反應(yīng)以及后續(xù)順利的肼解，轉(zhuǎn)化成肽酰肼。在肽酰肼活化為相應(yīng)的硫酯后，即可與另一種模型肽進(jìn)行 NCL，得到 Pac 標(biāo)記的連接產(chǎn)物。生物正交偶聯(lián)反應(yīng)，在實(shí)現(xiàn)生命體內(nèi)生物分子的成像、功能調(diào)節(jié)等方面具有十分重要的作用。2020年，研究人員基于環(huán)張力炔烴BCN，將四唑-烯烴光點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)拓展至四唑-炔烴。然而，該工作發(fā)展了反應(yīng)體系較為疏水，不利于在生命體中進(jìn)行應(yīng)用。【J. Am. Chem. Soc. | 光誘導(dǎo)的超快生物正交蛋白標(biāo)記】報(bào)道了一種水溶性的四唑-炔烴光點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，該體系由具有水溶性與空間屏蔽效應(yīng)的四唑分子，與具有環(huán)張力的BCN分子共同組成，具有極高反應(yīng)速率。轉(zhuǎn)肽酶通過特異性識(shí)別遺傳編碼的識(shí)別結(jié)構(gòu)域，可催化蛋白、多肽之間的偶聯(lián)反應(yīng)，在蛋白修飾與合成中具有重要應(yīng)用。Sortase介導(dǎo)的連接反應(yīng)（SML）是選擇性偶聯(lián)和修飾多肽以及蛋白質(zhì)的一種常用工具。連接反應(yīng)通過sortase識(shí)別保守的LPxTG基序（x可為任意氨基酸），在蘇氨酸處結(jié)合形成硫酯中間體，釋放下游序列，中間體可以進(jìn)一步和N端帶有甘氨酸的蛋白或多肽反應(yīng)實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。然而，多組分SML是十分困難的。但是，如果將底物的N端利用對(duì)光敏感的鄰硝基二甲氧基苯甲氧羰基(Nvoc)保護(hù)，變?yōu)殛P(guān)閉狀態(tài)，從而使底物C端暴露的基序可以與另一分子的N端實(shí)現(xiàn)連接，后續(xù)進(jìn)一步脫除底物N端保護(hù)基，能夠使N端從關(guān)閉狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)，實(shí)現(xiàn)與第三種分子的連接。通過調(diào)控底物從關(guān)閉狀態(tài)到活性狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，從而可以重復(fù)SML的過程，實(shí)現(xiàn)多片段連接【Angew. Chem. Int. Ed. | Sortase介導(dǎo)的多片段組裝】。
近期，天冬酰胺內(nèi)肽酶（AEPs），由于其更短的三肽識(shí)別結(jié)構(gòu)域和更高的酶促反應(yīng)效率，被視為下一代轉(zhuǎn)肽酶。然而，所有已知的轉(zhuǎn)肽酶都只能實(shí)現(xiàn)N端-C端的酶促偶聯(lián)反應(yīng)，限制了蛋白質(zhì)偶聯(lián)產(chǎn)物的潛在種類。通過開發(fā)工程化的天冬酰胺連接酶，能夠?qū)Φ孜镞x擇性進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而拓展偶聯(lián)反應(yīng)范圍。目前已開發(fā)出工程化的天冬酰胺連接酶[C247A]OaAEP1，另外通過構(gòu)建一個(gè)具有N端GLH序列以及C端Leu-Eda序列的多肽分子作為雙功能連接基團(tuán)，通過工程化酶實(shí)現(xiàn)兩蛋白質(zhì)之間的C端-C端偶聯(lián)【Angew. Chem. Int. Ed. | 工程化轉(zhuǎn)肽酶實(shí)現(xiàn)蛋白C端-C端偶聯(lián)】。2. 蛋白鄰近標(biāo)記方法
鄰近標(biāo)記策略是近些年來發(fā)展十分迅速的蛋白標(biāo)記方法，被廣泛應(yīng)用于蛋白-蛋白相互作用以及區(qū)域定位等方面。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用及質(zhì)膜上的蛋白質(zhì)周圍環(huán)境與細(xì)胞的生物功能、細(xì)胞過程密切相關(guān)，在不干擾細(xì)胞微環(huán)境的情況下檢測(cè)瞬時(shí)結(jié)合相互作用是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。盡管目前有BioID，TurboID和APEX等鄰近標(biāo)記手段，但是由于這些標(biāo)記過程中引入了不同的細(xì)胞毒性物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞的氧化還原通路等過程產(chǎn)生影響。因此，研究者們不斷嘗試開發(fā)不會(huì)引起顯著細(xì)胞毒性的鄰近標(biāo)記方法。NNMT催化S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)依賴性甲基化，將煙酰胺(NAM)轉(zhuǎn)化成N-甲基煙酰胺(Me-NAM)，4-氯吡啶同樣可以作為NNMT底物來生成相應(yīng)的甲基化產(chǎn)物。受到該酶促反應(yīng)的啟發(fā)，研究者設(shè)計(jì)了炔基取代的4-氯吡啶，作為自殺性探針，可以被NNMT催化甲基化，這種N-甲基化產(chǎn)物具有親電性，可以擴(kuò)散出活性位點(diǎn)并共價(jià)修飾近端蛋白質(zhì)上的半胱氨酸。將標(biāo)記的蛋白質(zhì)通過銅催化的疊氮化物-炔環(huán)加成(CuAAC)化學(xué)連接到生物素-疊氮化物，通過鏈霉親和素富集，就可以對(duì)鄰近的蛋白通過串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定【J. Am. Chem. Soc. | 特異性標(biāo)記半胱氨酸的鄰近標(biāo)記方法】。為了闡明蛋白質(zhì)周圍環(huán)境以及理解疾病的病理機(jī)制和發(fā)現(xiàn)疾病生物標(biāo)志物，一種能夠在內(nèi)源環(huán)境中用于鄰近標(biāo)記的核酸工具Apt-Gq/h被開發(fā)出來。Gq/h即G四鏈體/血紅素，是一種基于核酸的辣根過氧化物酶模擬物，已廣泛應(yīng)用于比色檢測(cè)、電化學(xué)傳感、蛋白修飾、和有機(jī)底物的氧化轉(zhuǎn)化。在這里，適配體作為一個(gè)錨結(jié)合感興趣的蛋白質(zhì)(POI)。G-四鏈體/血紅素復(fù)合物通過催化惰性小分子底物轉(zhuǎn)化為短壽命活性物質(zhì)來誘導(dǎo)對(duì)于POI的鄰近標(biāo)記。標(biāo)記的蛋白質(zhì)隨后可以進(jìn)行親和力富集和蛋白質(zhì)組學(xué)分析【Anal. Chem. | 用于選擇性和非遺傳性鄰近標(biāo)記膜蛋白的核酸工具】。此外，單線態(tài)氧被用于非酶促的組氨酸臨近標(biāo)記策略中，1-甲基-4-芳脲唑（MAUra）可以通過單電子轉(zhuǎn)移（SET）實(shí)現(xiàn)酪氨酸的標(biāo)記，而經(jīng)過單線態(tài)氧氧化的組氨酸從親核性氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛H電性小分子，進(jìn)一步可以被MAUra捕獲從而實(shí)現(xiàn)組氨酸的標(biāo)記，可以實(shí)現(xiàn)納米尺度的鄰近標(biāo)記【J. Am. Chem. Soc. | 單線態(tài)氧介導(dǎo)的鄰近組氨酸標(biāo)記策略】。
3. 應(yīng)用
近期，研究人員發(fā)現(xiàn)DNA表觀遺傳學(xué)修飾可能引發(fā)DNA-蛋白交聯(lián)（DPCs）的形成。DNA胞嘧啶中5位的甲?；?fC）是DNA表觀遺傳學(xué)標(biāo)記5mC在生物體內(nèi)氧化的代謝產(chǎn)物，可認(rèn)為是一種特殊的DNA表觀遺傳學(xué)標(biāo)記。由于芳甲?；顫姷姆磻?yīng)活性，5fC可以與組蛋白中Lysine或Arginine中的氨基形成可逆的席夫堿偶聯(lián)產(chǎn)物。【Angew. Chem. Int. Ed. | 位點(diǎn)特異性DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的合成及對(duì)DNA復(fù)制的影響】一文中，作者使用oxime ligation反應(yīng)，于體外合成了5fC與H3K4位點(diǎn)特異性的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)產(chǎn)物，并證實(shí)上述DPC對(duì)于DNA復(fù)制的阻礙，以及生命體對(duì)于上述DNA損傷潛在的克服方法。蛋白中的組氨酸殘基存在兩種互變異構(gòu)體，分別為氫原子位于ε位的氮原子上的Nε–H和氫原子位于δ位氮原子的Nδ–H，通常情況下組氨酸更傾向于形成Nε–H的形式，但在某些活性口袋內(nèi)部例如絲氨酸水解酶中，組氨酸的主要形式為Nδ–H。常用的蛋白標(biāo)記試劑DEPC很容易與組氨酸殘基反應(yīng)，并能與兩種互變異構(gòu)體形成不同的產(chǎn)物，從而對(duì)其進(jìn)行區(qū)分【Anal. Chem. | 通過蛋白共價(jià)標(biāo)記區(qū)分組氨酸互變異構(gòu)體】。進(jìn)一步的“功能性鄰近標(biāo)記(functionalproximity labeling)”策略，即通過結(jié)合鄰近標(biāo)記技術(shù)和特定蛋白類型富集策略，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定細(xì)胞區(qū)域內(nèi)特定蛋白種類的大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)分析，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定細(xì)胞區(qū)域內(nèi)的磷酸化蛋白，O-GlcNAc修飾蛋白，以及RNA結(jié)合蛋白的富集與檢測(cè)【Nat. Commun. | 功能性鄰近標(biāo)記實(shí)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白的時(shí)空分析】。鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacterbaumannii）是一種感染性革蘭氏陰性菌，由于其對(duì)大多數(shù)一線抗生素逐漸產(chǎn)生了耐藥性，而被世衛(wèi)組織認(rèn)為是需要立即關(guān)注的重點(diǎn)病原體，針對(duì)其的新型抗菌劑開發(fā)更是迫在眉睫。Pse在結(jié)構(gòu)上與哺乳動(dòng)物中的唾液酸結(jié)構(gòu)相似，而被稱為偽神經(jīng)氨酸，但由于其提取困難且具有抗原異質(zhì)性，而并未被成功應(yīng)用于疫苗策略中。通過鄰苯二醛和伯胺的特異性反應(yīng)將Pse小分子和載體蛋白CRM197或BSA連接在一起，得到疫苗分子Pse-CRM197和底物探針Pse-BSA，成功激起和維持有效的針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的免疫反應(yīng)，具有重要的臨床意義【ACS Cent. Sci. | 偽神經(jīng)氨酸-蛋白偶聯(lián)疫苗實(shí)現(xiàn)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抵抗】。4. 拓展
生物偶聯(lián)工具設(shè)計(jì)的傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)之一是與水具有兼容性，因此人們發(fā)展了各種巧妙的方法克服有機(jī)化學(xué)反應(yīng)在水中發(fā)生的困難。目前開發(fā)出一項(xiàng)替代型的生物偶聯(lián)策略，即使用與生物分子兼容的非水性介質(zhì)作為生物偶聯(lián)的反應(yīng)介質(zhì)，被稱為非水驅(qū)動(dòng)反應(yīng)溶劑中的生物偶聯(lián)(termed Bioconjugation In Nonaqueous-Driven Reaction Solvent，BINDRS)。研究人員在離子液體中成功實(shí)現(xiàn)了膦介導(dǎo)的氨基-疊氮生物偶聯(lián)【J.Am. Chem. Soc. | 變“不可能”為“可能”——離子液體作為反應(yīng)介質(zhì)推動(dòng)生物偶聯(lián)方法的開拓】。這種使用非傳統(tǒng)介質(zhì)的生物偶聯(lián)策略，大大擴(kuò)展了生物偶聯(lián)化學(xué)方法的范圍，期待更多原不可企及的生物偶聯(lián)的方式被發(fā)現(xiàn)。
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