Study on the anti-tumor mechanism related to immune microenvironment of Bombyx Batryticatus on viral and non-viral infections of hepatocellular carcinoma
家蠶免疫微環(huán)境對(duì)病毒和非病毒感染的肝細(xì)胞癌的抗腫瘤機(jī)制研究
肝細(xì)胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌的主要形式。肝癌的發(fā)生和發(fā)展主要是病毒的感染（如HBV或HCV），以及其他肝硬化的病因（包括非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD），酒精相關(guān)性肝病和遺傳性血色素沉著癥）。
HCC是一種免疫原性腫瘤，由潛在慢性肝臟疾病而出現(xiàn)在慢性發(fā)炎的肝臟中。這種炎癥導(dǎo)致腫瘤發(fā)展，并與更高的腫瘤免疫原性有關(guān)。HCC包括病毒感染和非病毒性環(huán)境，這兩類HCC執(zhí)行不同的基因表達(dá)和途徑。
作為一種輔助和替代藥物，中藥（TCM）療法已廣泛用于治療各種形式的癌癥。家蠶（Bombyx batryticatus（B. batryticatus））是中，韓，日醫(yī)學(xué)體系中常見的動(dòng)物藥物。家蠶許多抗腫瘤研究已經(jīng)證明了其對(duì)人類癌細(xì)胞系（例如子宮頸癌，肝癌和胃癌）的抗增殖作用。但是家蠶關(guān)于肝癌的機(jī)制仍不清楚。本文建立了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合的TME策略，以揭示家蠶對(duì)肝癌的藥理機(jī)制。
二、分析流程
通過ADME標(biāo)準(zhǔn)（吸收，分布，代謝和排泄）后，共從家蠶中選出6種活性化合物。（檞皮素、山奈酚、β-谷甾醇、胡蘿卜甾醇、金色酰胺醇酯、右旋杜仲樹脂粉）
6種蛋白質(zhì)與被相應(yīng)的化合物靶向（化合物節(jié)點(diǎn)和蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)連接在一起）（如圖A）
從靶向化合物參與的生物學(xué)過程可知（圖B），這些靶標(biāo)的生物學(xué)過程包括乙型肝炎，前列腺癌，胰腺癌，丙型肝炎，肝細(xì)胞癌等。
圖1. 活性化合物的過濾
篩選出HCC中重要的DEG，共1,404個(gè)基因。在這些DEG中，有1,007個(gè)上調(diào)，有397個(gè)下調(diào)。
A.火山圖代表DEG，可從圖形和標(biāo)注看出上調(diào)以及下調(diào)的基因。
B. HCC和HTA之間的DEG熱圖。
C.過濾出24個(gè)靶標(biāo)和2種化合物的子網(wǎng)。
圖2. DEG和核心子網(wǎng)過濾
STRING數(shù)據(jù)庫分析核心24個(gè)靶標(biāo)的潛在的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。KEGG富集的結(jié)果表明，最主要的5個(gè)途徑是乙型肝炎，肝細(xì)胞癌，化學(xué)致癌作用，類固醇激素的生物合成和p53信號(hào)途徑。作者選擇6個(gè)靶點(diǎn)及其鄰域（僅化合物）作為核心子網(wǎng)絡(luò)，將其分為5個(gè)模塊：乙型肝炎、肝癌、化學(xué)致癌、類固醇激素生物合成和p53信號(hào)通路。家蠶中的化合物具有多靶點(diǎn)效應(yīng)，可能參與多種與肝癌相關(guān)的途徑。
A.核心24個(gè)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。
B. KEGG的DEG富集。
圖3. 核心24個(gè)靶標(biāo)與KEGG富集的蛋白相互作用
熱圖顯示了22種免疫細(xì)胞亞型分別在VIR組和NVIR組的計(jì)數(shù)和激活狀態(tài)。（A：NVIR組；B：VIR組）
生存曲線：NVIR組的預(yù)后要優(yōu)于VIR組。
小提琴圖：NVIR組合和VIR組的4個(gè)TMES（漿細(xì)胞，肥大細(xì)胞活性，巨噬細(xì)胞（M1）和γδT細(xì)胞）顯著不同。（p<0.05)
圖4. HCC的腫瘤微環(huán)境
作者采用了多變量Cox回歸分析基因的預(yù)后。其中3個(gè)基因是VIR組的獨(dú)立因子，是高危因素（HR>1）。NVIR組14個(gè)基因與預(yù)后密切相關(guān)，14個(gè)基因與存活率顯著相關(guān)。
表1 VIR和NVIR的靶標(biāo)基因的預(yù)后分析
VIR組：AKR1C3與VIR中的巨噬細(xì)胞M1呈顯著負(fù)相關(guān)（cor = –0.35，p<0.001）；而在NVIR組中，AKR1C3和巨噬細(xì)胞M1之間的相關(guān)性非常低（cor = 0.064，p= 0.36）。
AKR1C3的生存曲線：高水平的AKR1C3在VIR組中預(yù)后較差（HR = 2.32，p= 0.012）。在NVIR組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p> 0.05）。
圖5. 預(yù)后目標(biāo)基因AKR1C3的分析
VIR組：NR1I2，CYP1A2和CYP3A4與VIR中的巨噬細(xì)胞M1相關(guān)性不大。它們均與巨噬細(xì)胞M1無關(guān)，高水平的靶標(biāo)和患者的預(yù)后無關(guān)（p>0.05)。
圖6. VIR組中的預(yù)后目標(biāo)分析
NVIR組：分析NVIR組中的這三個(gè)靶標(biāo)。它們均與巨噬細(xì)胞M1顯著相關(guān)，高水平靶標(biāo)NR1I2和CYP3A4對(duì)患者的預(yù)后要好于低水平(p<0.05)。
圖7. NVIR組中的預(yù)后目標(biāo)分析
結(jié)合位點(diǎn)：綠色，青色，紅色，藍(lán)色圓圈代表疏水性，極性，帶負(fù)電荷，帶正電荷的殘基。
山奈酚與靶標(biāo)結(jié)合方式的三維表征：結(jié)合部位的殘基以綠色棒狀物顯示，山奈酚以黃色棒狀物顯示。
在VIR組，AKR1C3與預(yù)后和巨噬細(xì)胞M1有關(guān)。下圖模擬了山奈酚與AKR1C3蛋白的相互作用，結(jié)果表明山奈酚可以很好地結(jié)合AKR1C3蛋白。
山奈酚與靶標(biāo)分子的結(jié)合位點(diǎn)。綠色，青色，紅色，藍(lán)色圓圈代表疏水性，極性，帶負(fù)電荷，帶正電荷的殘基。
山奈酚與靶標(biāo)分子結(jié)合方式的三維表征。結(jié)合部位的殘基以綠色棒狀物顯示，山奈酚以黃色棒狀物顯示。
在NVIR組，NR1l2、CYP1A2、CYP3A4與預(yù)后和巨噬細(xì)胞M1有關(guān)。下圖模擬了山奈酚與三種蛋白的相互作用，結(jié)果表明山奈酚可以較好結(jié)合這三種蛋白，對(duì)CYP1A2的包被作用最好。
槲皮素周圍殘基的電性槲皮素及其與靶分子的相互作用。綠色，青色，紅色，藍(lán)色圓圈代表疏水性，極性，帶負(fù)電荷，帶正電荷的殘基。
槲皮素與靶標(biāo)分子結(jié)合方式的三維表征。結(jié)合部位的殘基以綠色棒狀物顯示，槲皮素以黃色棒狀物顯示。
在NVIR組，NR1l2、CYP1A2、CYP3A4與預(yù)后和巨噬細(xì)胞M1有關(guān)。下圖模擬了槲皮素與三種蛋白的相互作用，結(jié)果表明槲皮素可以較好地結(jié)合這三種蛋白，其中與CYP1A2的結(jié)合最理想，與NR1l2的結(jié)合效果一般。
小結(jié)
作者過濾出家蠶的活性成分，以及過濾出HCC中差異表達(dá)的基因，得到活性成分的靶標(biāo)與DEG的重疊部分，篩選出重疊靶標(biāo)。隨后作者測試了VIR和NVIR中的靶標(biāo)，表征和量化了HCC免疫細(xì)胞亞型。作者分組分析靶標(biāo)與免疫微環(huán)境的相互作用，分析了它們對(duì)于患者的預(yù)后。結(jié)果表明：VIR組中靶蛋白AKR1C3與M1巨噬細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)，而NVIR組中相關(guān)性很弱，高水平的AKR1C3在VIR組中預(yù)后較差；在NVIR組中，NR1I2，CYP1A2和CYP3A4與巨噬細(xì)胞M1密切相關(guān)，而在VIR組相關(guān)性弱，高水平NR1I2和CYP3A4的預(yù)后較好。以上結(jié)果反映出家蠶的抗癌作用可能與免疫微環(huán)境密切相關(guān)。分子對(duì)接結(jié)果表明，槲皮素和山奈酚可以通過調(diào)節(jié)TME中的M1細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。
局限性：本研究僅研究了家蠶單一療法的抗肝癌機(jī)制。將來，有必要進(jìn)一步研究家蠶與其他中藥或西藥結(jié)合的作用機(jī)理。此外，本文忽略了家蠶的安全性，未確定家蠶的毒性成分。
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