Tumour-Infiltrating Immune Cell-Based Subtyping and Signature Gene Analysis in Breast Cancer Based on Gene Expression Profiles
經(jīng)過數(shù)據(jù)合并和過濾，納入來自12個GEO數(shù)據(jù)集、具有預后信息的801例乳腺癌樣本和964例正常組織樣本，平均隨訪5.54年，以及TCGA-BRCA的956個樣本、METABRIC的372個樣本。對樣本通過網(wǎng)頁工具CIBERSORT估計每個免疫細胞亞群的絕對免疫分數(shù)和豐度，gene signatures使用的是LM22和LM7，剔除其中CIBERSORT P value >= 0.05的樣本進行下一步分析。
表1：GEO、BRCA和METABRIC數(shù)據(jù)的乳腺癌患者臨床病理特征，展示了年齡、TNM分級、分子亞型等信息。
圖1：使用CIBERSORT計算的免疫細胞豐度，展示了兩種signatures文件計算得到的豐度（A和B）和三個數(shù)據(jù)集中豐度結(jié)果的P值（C和D）。
表1：乳腺癌患者臨床病理特征
圖1：CIBERSORT計算的免疫細胞豐度
在不同臨床病理特征分組中比較腫瘤浸潤免疫細胞亞群的估計豐度和分布。顯示免疫細胞在HER2過表達和三陰性亞型中更豐富，且總體豐度與不良病理特征有關(guān)，HR陰性(P < 0.001)、淋巴結(jié)陽性 (P= 0.01) 、較高的組織學分級(P < 0.001)。
進一步研究顯示淋巴結(jié)陽性的腫瘤中CD8 + T細胞和漿細胞百分比較高，而淋巴結(jié)陰性腫瘤中活化的肥大細胞，Treg細胞，靜息NK和DC百分比較高。隨著組織學等級的提高，巨噬細胞，幼稚B細胞和嗜中性粒細胞的百分比增加，而γδT細胞，Treg細胞和肥大細胞減少。
單因素Cox分析篩選預后相關(guān)的免疫細胞子集。結(jié)果顯示在管腔B，HER2過表達和三陰性乳腺癌中免疫細胞的豐度與生存率顯著相關(guān)。以風險比HR進行subgroup analysis，顯示所有浸潤細胞可分為保護相關(guān)survival-favourable、危險相關(guān)survival-unfavourable以及中性neutral 3個子集（表2）。
表2：腫瘤浸潤免疫細胞亞群的COX分析結(jié)果
基于單因素分析結(jié)果，作者使用GEO數(shù)據(jù)通過LASSO-Cox回歸進一步篩選免疫細胞亞群并在管腔B，HER2過表達和三陰性亞型中建立模型，從22個亞群中篩選出7個，根據(jù)免疫細胞豐度計算免疫風險評分immunorisk score（IRS）作為預后指標。IRS計算公式：
Immunorisk score = 2^((-0.056)* B cell+(-0.017)* CD8+T cell+0.151* γδT+(-0.060)* NK cell+(-0.165)* activated CD4+ memory T cell+(0.099)* activated mast cell+(0.177)*neutrophils)
構(gòu)建可預測3年和5年OS的列線圖（圖A），C指數(shù)0.71（95％CI：0.64-0.78），并展示了列線圖的校準曲線（圖B和C），顯示五年OS的預測準確度較高。
圖2：基于腫瘤浸潤免疫細胞的列線圖預后模型
圖3：列線圖模型的校準曲線
在GEO樣本中以年齡、腫瘤體積、淋巴結(jié)三種特征進行分組，分析IRS高低組的生存差異。結(jié)果顯示IRS在高風險組中更為準確：年齡大于50歲，腫瘤大于2 cm或淋巴結(jié)陽性的患者（圖4）
圖4：不同臨床病理特征分組的IRS生存曲線
使用TCGA-BRCA和METABRIC數(shù)據(jù)驗證Cox回歸模型，結(jié)果顯示較高的IRS在兩者中均預后不良，TCGA-BRCA（HR 11.80，95％CI：3.86-36.13，P <0.001）和METABRIC（HR 1.24，95％CI：1.02-1.51， P = 0.035）。
展示兩數(shù)據(jù)集中7種免疫細胞亞群的免疫評分熱圖（圖A）以及IRS四分位數(shù)分組的生存曲線（圖B）?？梢钥吹絀RS較高的樣本中Survival favourable細胞亞群免疫評分低，而Survival unfavourable亞群評分高。并且四分位數(shù)劃分的Q1-Q4 IRS的OS具有顯著性差異。以上驗證結(jié)果表明IRS可以作為乳腺癌預后指標。
圖5：IRS在TCGA-BRCA和METABRIC數(shù)據(jù)中的浸潤細胞免疫評分及OS驗證
在3種乳腺癌亞型中使用GEO隊列進行無監(jiān)督聚類分析。結(jié)果聚為兩類：免疫亞型A（immune-reactive）中survival-favourable的免疫細胞豐度更高；免疫亞型B (immune-nonreactive)中survival-unfavourable豐度高：Immunotype A （B_cellhigh NKhigh CD8+_ Thigh CD4+ _ memory_T_activatedhigh γδTlow Mast_cell_activatedlow Neutrophillow）；immunotype B （B_celllow NKlow CD8+_ Tlow CD4+_memory_T_activatedlow γδThigh Mast_cell_activatedhigh Neutrophilhigh)
圖6A展示了聚類分析熱圖結(jié)果和生存曲線，顯示在GEO數(shù)據(jù)中A、B兩型OS具有顯著差異。
在TCGA-BRCA和METABRIC數(shù)據(jù)中進行了驗證。免疫A型METABRIC數(shù)據(jù)中OS與B型具有顯著差異（圖6C）。
在三種乳腺癌分子亞型中進行多因素Cox分析，結(jié)果顯示Immunotype預后價值顯著。（表3）
圖6：基于免疫細胞亞群的無監(jiān)督聚類及生存分析
表3：三種乳腺癌分子亞型中的多因素COX分析
作者進一步比較了兩種免疫亞型的IRS、免疫細胞亞群豐度和生存差異。并且分析了重要免疫細胞因子和檢查點分子的表達差異。
免疫A型IRS顯著低于免疫B型，且survival-favourable細胞亞群免疫評分較高（圖7A-B）。
與免疫B型相比，免疫A型具有更好的5年OS（85.7％ vs 73.4％，P <0.001)，RFS，DFS和DMFS也顯著更好。（圖7C-F）
圖8比較幾種重要細胞因子IL-2、IFN-γ、TGF-β和免疫檢查點分子PD-L1、PD-1、CTLA-4在兩種免疫亞型中的表達。結(jié)果顯示GEO和TCGA-BRCA數(shù)據(jù)中免疫A型的IL-2和IFN-γ，PD-L1，PD-1和CTLA-4表達顯著高于B型。而TGF-β在B型中水平更高。
圖7：免疫A型、免疫B型的IRS差異分析和生存分析
圖8：兩種免疫亞型中重要免疫細胞因子和檢查點分子的表達
作者對兩種免疫亞型進行差異表達基因分析，鑒定出202個高表達的免疫相關(guān)基因。KEGG分析顯示這些基因與T細胞分化，NK細胞毒性，細胞因子-細胞因子受體相互作用，NF-κB信號通路等通路相關(guān) 。PPI分析表明該網(wǎng)絡由T細胞，B細胞和NK細胞相關(guān)基因和細胞因子組成。作者進一步對每個差異表達基因進行單因素和多因素Cox回歸分析，鑒定出與OS顯著相關(guān)的前列腺素D2合酶PTGDS。進一步分析乳腺癌中PTGDS的功能：
生物信息學結(jié)果：
圖9：在METABRIC數(shù)據(jù)中分析正常組和不同臨床病理特征組中PTGDS及其受體PTGDR的表達差異，結(jié)果顯示在腫瘤體積大（圖B,F）、高臨床分期（圖C,G）和高組織學分級（圖D）的腫瘤中，PTGDS和PTGDR的mRNA水平顯著下調(diào)，表明PTGDS可以作為保護因子。
作者還以平均PTGDS mRNA水平將樣本分為高低表達組進行了差異基因分析，顯示高低組間的差異基因與乳腺癌中的免疫相關(guān)通路有關(guān)。
最后對GEO樣本中PTGDS表達水平與免疫細胞亞群豐度進行了相關(guān)性分析，顯示PTGDS表達與保護性TILs的豐度正相關(guān)，而與危險性的M0/M2巨噬細胞、粒細胞豐度負相關(guān)。
圖9：METABRIC數(shù)據(jù)中不同臨床病理特征組PTGDS/PTGDR的表達差異
組織學結(jié)果：
在98例乳腺癌患者石蠟切片中進行了免疫組化（IHC）和免疫熒光（IF）檢測。圖10A顯示TNBC組織中基質(zhì)TILs的PTGDS表達明顯高于導管上皮細胞，與生信分析結(jié)果一致，圖10B顯示PTGDS在乳腺癌組織中表達不均勻。
PTGDS 和免疫細胞標志物的IHC和IF染色確定表達PTGDS的特定細胞類型。結(jié)果顯示，IHC染色中PTDGS與多種TILs標志物共表達（圖10C），IF染色顯示CD19 + / CD20 + B細胞和CD4 + / CD8 + T細胞均與PTGDS共定位（圖11）。
圖10：IHC檢測乳腺癌及癌旁組織中PTDGS的表達以及與不同免疫細胞亞群標志物的共表達
圖11：IF檢測TNBC乳腺癌組織中PTGDS與CD19+ B cells 和CD4+/CD8+ T cells 共定位
最后，作者根據(jù)IHC鑒定的平均PTGDS表達水平將98位患者分為高表達和低表達組分析臨床病理特征的差異。結(jié)果表明PTGDS的高表達與TIL高浸潤水平、腫瘤較小以及較早的病理分期有關(guān)，與生信分析的結(jié)果一致。
表4：PTGDS高表達組和低表達組臨床病理特征的差異
小結(jié)
作者首先使用CIBERSORT對樣本進行腫瘤浸潤免疫細胞亞群的豐度評估，然后進行單因素和多因素Cox分析篩選其中具有顯著預后意義的子集，在管腔B，HER2過表達和三陰性乳腺癌建立了以IRS作為浸潤免疫細胞指標的預后模型，并且對IRS的預后意義進行評估。接著對GEO樣本進行聚類，得到免疫A型、免疫B型兩類，在TCGA、METABRIC數(shù)據(jù)中進行了驗證，同樣分析了免疫分型的臨床病理特征差異及預后價值。最后作者篩選了免疫A型和免疫B型之間的差異表達基因，鑒定出特征基因PTGDS，進一步分析不同臨床病理特征分組的PTGDS表達差異，并通過IHC和IF驗證其在TILs中的特征表達。
