有一種活檢，
叫液體活檢；
液體活檢，顧名思義，就是利用人體體液（血液、胸水等）作為標(biāo)本來(lái)源檢測(cè)獲取腫瘤相關(guān)信息的技術(shù)，它是一種簡(jiǎn)單且非侵入性的組織活檢替代方法。1-2 具有患者依從性好，特異性好，異質(zhì)性低，可反復(fù)取材等優(yōu)勢(shì)。
有一種標(biāo)本，
叫胸水上清；
胸水上清，即胸水離心后的上清液，跟血液相比ctDNA濃度更高。按照突變檢出率排序的話，胸水上清（98%）>胸水細(xì)胞（89%）>外周血（86%）（當(dāng)然有組織優(yōu)選組織（100%））。3?在肺癌EGFR突變檢出率中，亦是如此：胸水上清（71%）>胸水細(xì)胞（68%）>外周血（59%）。4?胸水標(biāo)本在肺癌，乳腺癌和胃腸道癌等癌種中較常見(jiàn)。
2017年10月的第18屆世界肺癌大會(huì)（WCLC）上，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科暨上海市呼吸病研究所胡潔教授團(tuán)隊(duì)的童琳博士就報(bào)告了胸水上清的研究，證實(shí)胸水上清ctDNA具有更高的腫瘤特有突變檢出率和敏感性。憑借這項(xiàng)研究摘要，她獲得了2017 WCLC的Travel Award（旅行獎(jiǎng)）。3
▲?2017年WCLC，胡潔教授團(tuán)隊(duì)的童琳博士所作報(bào)告
時(shí)隔近兩年，2019年7月28日，該項(xiàng)研究結(jié)果正式發(fā)表于《Theranostics》雜志（IF=8.063），通過(guò)比較分析胸水上清、細(xì)胞沉渣、組織切片及外周血4種樣本的基因圖譜，進(jìn)而證實(shí)了胸水上清標(biāo)本進(jìn)行基因檢測(cè)的有效性和準(zhǔn)確性，并進(jìn)一步證實(shí)胸水上清標(biāo)本在臨床應(yīng)用可能性。4
▲?胸水上清研究方案路徑及臨床指導(dǎo)意義
63例轉(zhuǎn)移性肺癌患者，根據(jù)有無(wú)匹配腫瘤樣本分為兩個(gè)隊(duì)列，隊(duì)列1有匹配組織樣本（n=30），隊(duì)列2無(wú)匹配組織樣本（n=33）。同時(shí)采集每位患者的胸水和血漿樣本。分別對(duì)胸水上清和細(xì)胞沉渣進(jìn)行DNA提取，分別簡(jiǎn)稱為胸水上清細(xì)胞游離DNA（PE-cfDNA）和細(xì)胞沉渣DNA（sDNA）。所有樣本都使用了南京世和基因 416基因?NGS大panel 進(jìn)行測(cè)序。
▲ 63例患者登記和樣本收集的研究設(shè)計(jì)
血漿ctDNA檢測(cè)：EDTA抗凝管采集 8~10ml外周血，2h內(nèi)采用兩步離心法分離出血漿和血細(xì)胞，血漿做ctDNA檢測(cè)，血細(xì)胞（白細(xì)胞）做對(duì)照檢測(cè)；
腫瘤組織檢測(cè)：FFPET 樣本由病理學(xué)家測(cè)定每個(gè)樣本的腫瘤細(xì)胞含量，然后進(jìn)行組織的基因檢測(cè)；
胸水樣本檢測(cè)：采集3~6ml胸水樣本，用2500g離心15min，將上清液與漂浮細(xì)胞分離，上清液抽提PE-cfDNA，細(xì)胞沉渣（需要細(xì)胞涂片在400X倍鏡下評(píng)估腫瘤細(xì)胞含量）抽提sDNA；
文庫(kù)制備：KAPA Hyper Prep Kit；
測(cè)序方法：Illumina HiSeq 4000平臺(tái)，2×150bp 雙端測(cè)序；
檢測(cè)靈敏度：腫瘤組織和細(xì)胞沉渣?0.5%，血液和胸水上清 0.1%，準(zhǔn)確判斷至少需要存在三條獨(dú)立的reads（GATK）。
①?胸水上清中ctDNA（PE-cfDNA）含量遠(yuǎn)高于胸水沉渣細(xì)胞DNA（sDNA）和血漿ctDNA。提示PE-cfDNA具有更高的突變檢出率及更高的突變檢出豐度：胸水上清（98.4%）>胸水細(xì)胞（90.5%）>外周血（87%），避免血檢造成的假陰性。
②?在匹配腫瘤組織的隊(duì)列1中，PE-cfDNA的腫瘤突變負(fù)荷（TMB）與腫瘤組織相似（中位TMB 6.4 vs?5.6)，但明顯高于胸水細(xì)胞沉渣 sDNA（中位TMB 3.3）和血漿cfDNA（中位TMB 3.4）。
▲ 四種樣本類型檢測(cè)TMB的情況對(duì)比
③?在組織檢測(cè)的驅(qū)動(dòng)突變中，93%（27/29）在PE-cfDNA中檢測(cè)到，包括ALK、BRAF、EGFR、ERBB2、KRAS、NF1、PIK3CA 和 RET 的突變，而在血漿 cfDNA 中檢出率僅有 62%。在整個(gè)隊(duì)列中，PE-cfDNA對(duì)EGFR驅(qū)動(dòng)突變的檢出率最高：胸水上清（71%）>胸水細(xì)胞（68%）>外周血（59%），避免血檢造成的假陰性。
④?比較分析ARMS-PCR和NGS檢測(cè)不同樣本EGFR突變的情況。證明NGS的方法是可行的，且胸水上清樣本檢出率是最高的。
▲ A) ARMS和NGS檢測(cè)不同樣本EGFR突變；B) NGS總檢出率。
⑤?胸水上清可克服胸水細(xì)胞學(xué)陰性和血性胸水檢測(cè)突變的困難。即使是細(xì)胞學(xué)陰性，胸水上清 PE-cfDNA 仍可能檢出突變；即使是血性胸水含有有核細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞被稀釋而降低胸水細(xì)胞沉渣的突變檢測(cè)敏感性，但胸水上清的檢出率并不受影響。PE-cfDNA與 sDNA 在血性胸水和非血性胸水中的檢測(cè)靈敏度分別為：72% vs 81%，34% vs 64%。
在這種情況下，我們可發(fā)現(xiàn) PE-cfDNA 比 sDNA 表現(xiàn)出絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明 PE-cfDNA 是腫瘤DNA的獨(dú)立來(lái)源，受腫瘤細(xì)胞豐度影響較小。
▲ C) 胸腔積液腫瘤細(xì)胞（+）或腫瘤細(xì)胞（-）中PE-cfDNA和sDNA檢測(cè)的靈敏度對(duì)比；D) 血性胸水和非血性胸水中PE-cfDNA和sDNA檢測(cè)的靈敏度對(duì)比。
當(dāng)腫瘤組織不可用時(shí)，PE-cfDNA比 sDNA 和 血漿cfDNA 更適合用于基因組分析，而且可能更精細(xì)，是一種很有前途的腫瘤組織替代物。
研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明，在細(xì)胞學(xué)陰性或血性胸水標(biāo)本中，PE-cfDNA比 sDNA 和 血漿cfDNA?具有更高的突變檢測(cè)靈敏度，是一種更可靠的基因檢測(cè)標(biāo)本來(lái)源。
2018年《中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表的《液體活檢在臨床腫瘤診療應(yīng)用和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)踐中的專家共識(shí)》，對(duì)胸水樣本的采集及處理提出了應(yīng)用的建議：臨床醫(yī)師可通過(guò)胸膜腔穿刺術(shù)，采集胸腔積液 20 ml 置于預(yù)添加 EDTA 抗凝劑的無(wú)菌容器中（采集量視具體情況而定），采集完畢應(yīng)即刻送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，常溫保存。建議 2 h 內(nèi)完成兩步離心分離上清（同血漿分離步驟），分離后的上清可直接進(jìn)行抽提或保存于 -80 ℃冰箱直至抽提。6?
如果需要長(zhǎng)途保存運(yùn)輸，亦可采用cfDNA管（比如Streck管）采集胸腔積液 8~10ml 兩管（約20ml左右），顛倒混勻后，常溫（6~37℃）保存運(yùn)輸。cfDNA管中的游離DNA保護(hù)液不僅可以防RBC溶血，防WBC基因組DNA污染，還可以抑制核酸酶降解游離DNA。（基因Talks建議，僅供參考）
參考資料：
1.Wan Jonathan C M,Massie Charles,Garcia-Corbacho Javier et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA.[J] .Nat. Rev. Cancer, 2017, 17: 223-238.
2.Abbosh Christopher,Birkbak Nicolai J,Wilson Gareth A et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution.[J] .Nature, 2017, 545: 446-451.
3.Tong L, Ding N, Li J, et al. MA 20.13 etDNA: Tumor-Derived DNA from Pleural Effusion Supernatant as a Promising Source for NGS-Based Mutation Profiling in Lung Cancer[J]. Journal of Thoracic Oncology, 2017, 12(11): S1891.
4.Tong L, Ding N, Tong X, Li J, Zhang Y, Wang X, Xu X, Ye M, Li C, Wu X, Bao H, Zhang X, Hong Q, Song Y, Shao YW, Bai C, Zhou J, Hu J. Tumor-derived DNA from pleural effusion supernatant as a promising alternative to tumor tissue in genomic profiling of advanced lung cancer.?Theranostics?2019; 9(19):5532-5541.
5.Gandara David R,Paul Sarah M,Kowanetz Marcin et al. Blood-based tumor mutational burden as a predictor of clinical benefit in non-small-cell lung cancer patients treated with atezolizumab.[J] .Nat. Med., 2018, 24: 1441-1448.
6.《液體活檢在臨床腫瘤診療應(yīng)用和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)踐中的專家共識(shí)》,中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2018年10月第41卷第10期.
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