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β-地中海貧血(簡(jiǎn)稱“β-地貧”)是一種常見(jiàn)的由于β-珠蛋白(β-globin)亞基突變導(dǎo)致成人血紅蛋白(Adult Hemoglobin，HbA，由β-globin和α-globin組成)異常的遺傳性疾病。異體造血干細(xì)胞移植可根治“地貧”，但限制條件太多，并不能得到廣泛應(yīng)用。臨床發(fā)現(xiàn)，疾病嚴(yán)重程度與胎兒血紅蛋白(Fetal Hemoglobin，HbF，由γ-globin和α-globin組成)的含量密切相關(guān)，部分病人體內(nèi)HbF較多,則并發(fā)癥較輕，死亡率也低，因此，增加病人體內(nèi)HbF的含量是治療或緩解這類貧血的重要方法之一。γ-globin是一種胎兒時(shí)期表達(dá)的珠蛋白，該珠蛋白具有和β-globin相似的功能，編碼該蛋白的基因HBG在上述貧血患者中序列完好，但到成年期表達(dá)便會(huì)被沉默。因此，重新激活患者體內(nèi)γ-globin基因的表達(dá)來(lái)彌補(bǔ)缺損的β-globin是近年來(lái)興起的一種治療策略。

先前研究發(fā)現(xiàn)，BCL11A 基因在紅細(xì)胞中具有抑制γ-globin基因的表達(dá)的作用。這些研究提示，在患者造血干細(xì)胞中靶向編輯 BCL11A 紅系增強(qiáng)子會(huì)重新激活HbF的表達(dá)，再將高效編輯后的造血干細(xì)胞移植給患者重建造血，可產(chǎn)生高表達(dá)HbF的紅細(xì)胞，且不會(huì)影響淋巴細(xì)胞的分化、成熟【1,2】。

2019年3月25日，華東師范大學(xué)吳宇軒研究員、哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院及波士頓兒童醫(yī)院曾靜和Daniel E. Bauer教授團(tuán)隊(duì)在Nature Medicine雜志發(fā)表題為Highly efficient therapeutic gene editing of human hematopoietic stem cells的研究論文，該研究證實(shí)通過(guò)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)有望徹底根治由β-globin珠蛋白突變引發(fā)的系列遺傳疾病【3,4】。

首先，本研究通過(guò)比較不同的sgRNA，優(yōu)化編輯系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了CRISPR/Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 在人CD34+造血干/祖細(xì)胞中的高效基因編輯，然后通過(guò)編輯紅系特異增強(qiáng)子BCL11A +58位點(diǎn)造成BCL11A在紅細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。在將編輯過(guò)后的CD34+細(xì)胞體外紅系分化后，發(fā)現(xiàn)BCL11A的表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)HbF的含量得到極大提升。本研究還對(duì)多種地中海貧血類型的患者來(lái)源CD34+細(xì)胞進(jìn)行了編輯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分化后的紅細(xì)胞分化更加成熟、體積和形態(tài)都恢復(fù)至接近于健康細(xì)胞水平。但是，研究人員發(fā)現(xiàn)盡管其在人CD34+細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了高達(dá)80%的編輯效率，編輯后的干細(xì)胞在移植至小鼠骨髓4個(gè)月后編輯效率卻出現(xiàn)了大幅度下降 (降至約平均40%) 。研究人員推測(cè)這可能是因?yàn)镃D34+細(xì)胞中比例極低但是對(duì)造血干細(xì)胞長(zhǎng)期歸巢和增殖有關(guān)鍵作用的長(zhǎng)期造血干細(xì)胞 (LT-HSCs) 更不容易被Cas9編輯。因此，他們進(jìn)一步優(yōu)化了Cas9原核表達(dá)載體和編輯系統(tǒng)，使得CD34+細(xì)胞在體外的編輯效率進(jìn)一步提高到了98%。

編輯后的造血干細(xì)胞移植至免疫缺陷小鼠體內(nèi)4個(gè)月后仍然保持著90%以上的編輯效率，并且能在小鼠骨髓中成功重建人源血液系統(tǒng)，同時(shí)分化得到的紅細(xì)胞含有高比例的HbF。另外，研究發(fā)現(xiàn)人長(zhǎng)期造血干細(xì)胞LT-HSCs在被Cas9編輯后更傾向于被非同源末端連接 (NHEJ) 的方式修復(fù)，而非微同源末端連接(MMEJ)。最后，研究人員證明了鐮刀狀貧血病人來(lái)源的CD34+細(xì)胞也能被高效編輯且在編輯后移植至小鼠體內(nèi)重建人源血液系統(tǒng)，同時(shí)紅細(xì)胞中HbF的提升水平足以幫助細(xì)胞恢復(fù)正常形態(tài)，抵抗鐮刀化。此外，研究人員還用CIRCLE-seq鑒定了一批潛在脫靶位點(diǎn)，并對(duì)潛在的脫靶位點(diǎn)和上百個(gè)可能的白血病突變位點(diǎn)進(jìn)行了深度測(cè)序，結(jié)果顯示這些位點(diǎn)并沒(méi)有出現(xiàn)異常的插入或缺失，證實(shí)了Cas9 RNP介導(dǎo)的CD34+細(xì)胞中的基因編輯是一種極其安全的治療策略。

綜上，通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)編輯β-地中海貧血和鐮刀狀貧血患者造血干細(xì)胞中的BCL11A增強(qiáng)子位點(diǎn)，并進(jìn)行自體造血干細(xì)胞移植，可以使得體內(nèi)分化產(chǎn)生具有高比例HbF及正常功能血紅蛋白的紅細(xì)胞，從而有可能徹底根治此類疾病。相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)于2018年獲得FDA批準(zhǔn)，由醫(yī)藥公司Vertex/CRISPR therapeutics主導(dǎo)，在美國(guó)和歐洲開(kāi)展針對(duì)β-地中海貧血和鐮狀細(xì)胞病的I/II期臨床實(shí)驗(yàn)。

通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)激活胎兒血紅蛋白HbF，結(jié)合自體造血干細(xì)胞移植治療血紅蛋白病示意圖(Lettre and Bauer. Lancet. 2016)

我國(guó)“地貧”基因攜帶者約3000萬(wàn)人，涉及近3000萬(wàn)家庭、一億人口，其中重型和中間型“地貧”患者約30萬(wàn)人。而由于異體造血干細(xì)胞配型困難和血庫(kù)資源不足，這些患者很多都不能得到有效治療。因此，此項(xiàng)研究及其臨床實(shí)驗(yàn)的推廣有望為我國(guó)β-地中海貧血患者提供全新的基于自體干細(xì)胞移植的臨床方案，造福廣大患者和社會(huì)。 

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41591-019-0401-y

制版人：珂

1. Y. Yu, J. Wang, W. Khaled, S. Burke, P. Li, X. Chen, W. Yang, N.A. Jenkins, N.G. Copeland, S. Zhang, Bcl11a is essential for lymphoid development and negatively regμlates p53, Journal of Experimental Medicine, 209 (2012) 2467-2483.

2. J. Xu, C. Peng, V.G. Sankaran, Z. Shao, E.B. Esrick, B.G. Chong, G.C. Ippolito, Y. Fujiwara, B.L. Ebert, P.W. Tucker, Correction of Sickle Cell Disease in Adμlt Mice by Interference with Fetal Hemoglobin Silencing, Science, 334 (2011) 993-996.

3. D.E. Bauer, S.C. Kamran, L. Samuel, X. Jian, F. Yuko, L. Carrie, S. Zhen, M.C. Canver, E.C. Smith, P. Luca, An Erythroid Enhancer of BCL11A Subject to Genetic Variation Determines Fetal Hemoglobin Level, Science, 342 (2013) 253-257.

4. Canver, M. C. et al. BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis. Nature 527, 192–197 (2015).