生物醫(yī)學(xué)科研實驗，互助你我。今天，我們給大家?guī)淼氖茄芯啃盘柾?，常?guī)實驗WB，其常見問題的分析。
1. 沒有足夠的一抗或二抗結(jié)合目標蛋白
適當?shù)奶岣呖贵w的稀釋比例，或者延長4度孵育時間
2. 抗原量不足或者蛋白樣品降解
適當?shù)奶岣呱蠘恿?，或者盡量使用新鮮的樣本組織。并且加入蛋白酶抑制劑
3. 轉(zhuǎn)膜不充分
使用可逆染色劑例如麗春紅S檢測轉(zhuǎn)膜效果,檢查轉(zhuǎn)膜操作是否正確。PVDF膜需預(yù)先浸在甲醇中，然后浸到轉(zhuǎn)移緩沖液中。
4. 過度封閉使目標蛋白不能顯色
代替5% 脫脂奶粉，使用含0.5% 脫脂奶粉或無脫脂奶粉的抗體稀釋液，或更換封閉劑，減少封閉時間。
5.一抗不識別檢測物種的蛋白
參照說明書，比對免疫原序列和蛋白序列以確?？贵w和目的蛋白會發(fā)生反應(yīng)，設(shè)置陽性對照。
6. 組織中目的蛋白含量低
濃縮使信號最大化（例如檢測核蛋白要用核裂解物）。
7. 洗膜過度
勿過度洗膜
8. 二抗受疊氮鈉抑制
避免疊氮鈉和HRP標記抗體一起使用。如果一抗中含有疊氮鈉，一抗完后洗膜充分
9. 檢測試劑盒過期和底物失活
使用新鮮的底物。
1. 未進行非特異性封閉或封閉不充分：延長封閉時間，考慮更換合適的封閉劑
2. 一抗?jié)舛冗^高：稀釋抗體至合適濃度，以更高稀釋度抗體孵育更長時間（耗時長但特異性結(jié)合最好）。
3.抗體孵育溫度過高：4°C孵育。
4.一抗或二抗與封閉劑有交叉反應(yīng)：在孵育和洗滌液中加入溫和去污劑如吐溫-20。脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白，會結(jié)合磷酸化特異性抗體而易產(chǎn)生高背景。使用BSA代替奶粉作為封閉劑
5. 未結(jié)合蛋白質(zhì)洗滌不充分：增加洗滌次數(shù)
6. 膜的選擇導(dǎo)致的高背景：NC膜比PVDF膜背景低
7. 膜干燥：在孵育過程中防止膜變干，在任何步驟都保證膜有充分的反應(yīng)液，放入攪拌子不斷攪動或輕輕振蕩使膜浸在溶液中，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象。
1. 體內(nèi)表達的蛋白樣本具有多種修飾形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等：查閱文獻，使用試劑使樣品去磷酸化、去糖基化來驗證翻譯后的修飾。
2. 蛋白樣本降解（蛋白質(zhì)分子量降低）：在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑
3. 檢測到未經(jīng)報道過的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結(jié)構(gòu)不同的蛋白：查閱其它文獻報道，或BLAST搜尋，使用說明書推薦的細胞株或組織。
4. 一抗?jié)舛冗^高，高濃度時常出現(xiàn)多條蛋白帶：降低抗體濃度和/或孵育時間。
5. 二抗?jié)舛冗^高，高濃度產(chǎn)生非特異性結(jié)合：降低抗體濃度，增加二抗對照（不加一抗）
6. 條帶為非特異性條帶：應(yīng)用封閉多肽來區(qū)分特異性和非特異性條帶，只有特異性條帶能被封閉從而消失。
7. 靶蛋白形成多聚體：SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸10分鐘而不是5分鐘，使蛋白質(zhì)解聚。
