2.1 RNA甲基化修飾m6A調(diào)控造血干細胞定向分化

METTL3介導(dǎo)的m6A修飾在生物節(jié)律、DNA損傷應(yīng)答、干細胞的自我更新和多能性調(diào)控、母源?合子轉(zhuǎn)換、果蠅神經(jīng)功能調(diào)節(jié)與性別決定、小鼠早期胚胎發(fā)育等真核生物的各種生物學(xué)過程和個體發(fā)育中發(fā)揮著非常重要的作用。RNA甲基修飾酶和結(jié)合蛋白及其參與RNA 代謝加工的發(fā)現(xiàn)，提示RNA甲基化修飾具有重要生物學(xué)功能。

脊椎動物中，造血干細胞最初由特化的生血內(nèi)皮通過內(nèi)皮?造血轉(zhuǎn)化過程(EHT)產(chǎn)生于胚胎期主動脈?性腺?中腎區(qū)，隨后向血組織遷移并進行擴增，向胸腺遷移發(fā)育為淋系細胞，最后向骨髓(小鼠和人)或腎髓(斑馬魚)遷移以維持終生造血。通過 m6A 抗體進行MeRIP-seq和m6A單堿基分辨率的 miCLIP-seq測序技術(shù)，繪制了斑馬魚胚胎發(fā)育的m6A修飾精細圖譜，發(fā)現(xiàn)m6A通過特異性修飾內(nèi)皮?造血轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵基因notch1a，招募結(jié)合蛋白YTHDF2降解mRNA，抑制了Notch信號通路，使得內(nèi)皮?造血轉(zhuǎn)化過程有序發(fā)生，促進內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化為造血干/祖細胞(HSPCs)。在mettl3缺陷的斑馬魚胚胎中，m6A修飾水平顯著降低，notch1a無法正常降解使得Notch信號通路持續(xù)激活，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細胞無法正常轉(zhuǎn)化為造血干/組細胞。此外，Mettl3 敲除小鼠胚胎中也表現(xiàn)出相似的表型。這些結(jié)果揭示mRNA m6A甲基化修飾在脊椎動物造血干細胞命運決定中的調(diào)控機制，闡釋RNA的表觀修飾在血液發(fā)育中的關(guān)鍵作用。

2.2 RNA 甲基化修飾m6A調(diào)控精子發(fā)生

由于Mettl3敲除會導(dǎo)致小鼠早期胚胎致死，Mettl3條件敲除介導(dǎo)的m6A修飾在哺乳動物體內(nèi)組織發(fā)育中的生物學(xué)功能還不清楚。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的同源重組技術(shù)和 Cre-loxP系統(tǒng)成功地建立了生殖細胞(Vasa-Cre)中特異性敲除Mettl3 的小鼠(Mettl3^CKO)模型，并利用該模型系統(tǒng)地研究了METTL3介導(dǎo)的m6A修飾在小鼠精子發(fā)生過程中的重要作用和調(diào)控機制。通過 H&E(蘇木素?伊紅)染色、免疫熒光染色、核染色體鋪片等研究表明，Mettl3敲除會抑制小鼠精原干細胞分化和減數(shù)分裂起始過程，最終導(dǎo)致雄性小鼠不育。通過 RNA-seq、m6AmiCLIP-seq和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Mettl3 缺失會導(dǎo)致m6A水平下降，引起與精原干細胞維持和分化、細胞周期和減數(shù)分裂相關(guān)基因的RNA可變剪接異常和生殖細胞整體基因表達的紊亂，最終導(dǎo)致精子發(fā)生過程受阻，說明RNA甲基轉(zhuǎn)移酶 METTL3介導(dǎo)的m6A修飾在哺乳動物小鼠精子發(fā)生過程中的重要生物學(xué)功能。

在小鼠生殖細胞中用Vasa-Cre特異性敲Mettl3或者Mettl14會導(dǎo)致m6A水平下降，引起精原干細胞增殖和分化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄物的翻譯功能失調(diào)，精原干細胞逐漸耗盡；利用 Stra8-GFPCre同時敲除Mettl3和Mettl14，會破壞精子發(fā)生過程中單倍體特異性基因的翻譯，最終導(dǎo)致精子形成受阻。而雄性m6A去甲基酶Alkbh5^-/-小鼠也出現(xiàn)睪丸變小、生精異常、精子活力異常等表型；同時在發(fā)育至Ⅶ期的生精小管中檢測到初級與次級精母細胞數(shù)量顯著增加，粗線精母細胞與成熟精子的數(shù)量明顯減少，同時伴有細胞凋亡。Ythdc2敲除小鼠也發(fā)生在精細胞減數(shù)分裂前期出現(xiàn)過度的細胞凋亡，從而導(dǎo)致睪丸變小及精子發(fā)育異常。YTHDC2的m6A結(jié)合能力及其3′→5′解旋酶活性對于維持精子發(fā)育過程中減數(shù)分裂相關(guān)基因的正確表達模式具有重要調(diào)控功能。上述研究提示RNA m6A甲基化修飾的動態(tài)平衡是配子(精子)發(fā)育過程中重要的調(diào)控因素。

2.3 RNA 甲基化修飾 m6A 調(diào)控腦發(fā)育

m6A修飾在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及功能的行使中也發(fā)揮不可替代的調(diào)控作用。m6A RNA甲基化修飾在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及功能行使中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。敲除Ime4基因的果蠅可以出生并存活，但果蠅壽命變短，并表現(xiàn)出明顯的行為異常，提示m6A修飾的缺失影響果蠅神經(jīng)系統(tǒng)功能。在小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異地敲除Mettl14基因會嚴重影響小鼠大腦皮質(zhì)的發(fā)育。小鼠中Ythdf2基因缺失導(dǎo)致m6A整體水平升高，使得參與神經(jīng)干細胞分化和神經(jīng)元軸樹突形成的重要因子無法正常進入RNA降解途徑，從而導(dǎo)致大腦皮層神經(jīng)干細胞不能正常地進行不對稱分裂，造成神經(jīng)前體細胞的大量缺失、嚴重影響神經(jīng)元的分化，致使小鼠的前腦大腦皮層發(fā)育緩慢。除大腦皮層外，小腦的RNAm6A甲基化模式和水平尤為突出。m6A甲基化與去甲基化的動態(tài)過程貫穿于小腦出生后發(fā)育的整個過程，且在低壓低氧環(huán)境下Alkbh5基因缺失造成參與小腦發(fā)育調(diào)控進程基因的m6A水平紊亂，加快了RNA出核過程，從而導(dǎo)致小腦發(fā)育明顯滯后。

通過Cre-loxP系統(tǒng)在小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異性地敲除Mettl3基因，以探究m6A甲基化修飾對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異地敲除Mettl3導(dǎo)致小鼠在哺乳期表現(xiàn)出嚴重的運動功能障礙，并導(dǎo)致死亡。解剖和病理切片檢測發(fā)現(xiàn)由Mettl3敲除引起的 m6A甲基化修飾的缺失嚴重影響大腦皮層和小腦的發(fā)育，導(dǎo)致大腦皮層偏薄和小腦發(fā)育不良。m6甲基化修飾的缺失引起小腦內(nèi)顆粒神經(jīng)元分化和成熟過程中基因表達調(diào)控紊亂，導(dǎo)致新生的顆粒神經(jīng)元大量凋亡，揭示了 METTL3介導(dǎo)的m6A修飾在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的重要作用。

除了對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響，m6A修飾也參與成體的神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控，神經(jīng)軸突損傷會促使神經(jīng)細胞內(nèi)m6A修飾水平提高，進而提高包括軸突再生相關(guān)基因在內(nèi)的一系列基因的蛋白質(zhì)翻譯效率。

2.4 RNA甲基化修飾m6A與RNA代謝

目前越來越多的研究表明，從細胞核內(nèi)的前體mRNA 加工、mRNA表達到細胞質(zhì)的 mRNA翻譯和降解，m6A幾乎參與調(diào)控了RNA加工代謝的各個過程。在細胞核內(nèi)，m6A 通過結(jié)合蛋白YTHDC1招募SRSF3，參與調(diào)控前體mRNA的選擇性剪接過程；通過調(diào)控最后一個外顯子的選擇性剪接，參與調(diào)控腺苷多聚體的多樣性；而m6A修飾酶體系METTL3、ALKBH5和 YTHDC1還被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控mRNA的出核過程。在細胞質(zhì)中，m6A調(diào)控翻譯的機制十分多樣，既有通過YTHDF1-eIF3通路調(diào)控mRNA翻譯效率的方式，也存在 IGF2BP家族蛋白介導(dǎo)的調(diào)控過程，并且在應(yīng)激狀態(tài)下，m6A參與一類不依賴于5′ 帽子的翻譯調(diào)控通路；并且其對mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控也存在不同的通路，既包括通過YTHDF2將 mRNA招募至P小體降解mRNA的調(diào)控方式，近期有報道指出IGF2BP家族蛋白通過特異性結(jié)合m6A修飾mRNA維持其穩(wěn)定性。此外，m6A還可通過調(diào)控RNA的二級結(jié)構(gòu)調(diào)控其代謝過程。

2.5 RNA甲基化修飾m5C的生物學(xué)功能

近年來越來越多的研究表明，mRNA上的m5C修飾在RNA加工代謝及正常生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，包括RNA代謝、干細胞分化及應(yīng)激反應(yīng)等過程。對小鼠胚胎干細胞和大腦的研究表明，在干細胞分化不同時期，m5C修飾水平和分布明顯不同。在擬南芥中，mRNA上的m5C修飾呈現(xiàn)組織特異性，且對植物發(fā)育非常重要。擬南芥中的m5C甲基轉(zhuǎn)移酶TRM4B突變體植株的根頂端分生組織細胞分裂受阻，從而導(dǎo)致除根較短，并且對氧化應(yīng)激非常敏感。

3 小結(jié)

在讀碼器和消碼器的共同作用下，RNA m6A修飾水平得以實現(xiàn)動態(tài)調(diào)控，并通過招募不同的結(jié)合蛋白實現(xiàn)對RNA加工過程的精細調(diào)控。雖然該研究領(lǐng)域還有部分觀點存在不確定性，需要在將來投入更多的研究工作來證明。目前通過改造DNA聚合酶實現(xiàn)m6A修飾位點錯配以檢測單堿基精度的m6A轉(zhuǎn)錄組修飾水平，以及借助納米孔測序直接檢測轉(zhuǎn)錄本上鑒定 RNA修飾的技術(shù)，已成為領(lǐng)域內(nèi)最熱門的研究熱點。該技術(shù)的實現(xiàn)，將成為闡明m6A修飾動態(tài)調(diào)控機制及其分子功能的核心關(guān)鍵。

對于m5C修飾，更為精確的m5C檢測方法的開發(fā)對于高可信度的m5C修飾譜的建立至關(guān)重要。同樣，納米孔測序?qū)τ趍5C的研究也非常重要。其次，m5C的書寫器、閱讀器和擦除器的研究才剛剛開始，這些方向的發(fā)展將為揭示RNA m5C修飾的生物學(xué)功能提供線索。此外，由m5C氧化產(chǎn)生的5-羥甲基?胞嘧啶(hm5C)等新型RNA修飾類型的特征及功能也有待未來進行深入研究。

除了m6A與m5C之外，RNA新型化學(xué)修飾也是近期研究的熱點。最近研究人員發(fā)現(xiàn) mRNA上還存在另外一種新型甲基化修飾——m1A，研究人員利用特異識別m1A的抗體來富集含有m1A的RNA片段并結(jié)合高通量測序，獲得了全轉(zhuǎn)錄組水平的m1A甲基化譜圖，發(fā)現(xiàn)m1A特異富集在5′非翻譯區(qū)(5′UTR)區(qū)域；并且，還發(fā)展出單堿基分辨率的m1A 檢測方法，發(fā)現(xiàn)核編碼和線粒體編碼轉(zhuǎn)錄本上存在不同類型的m1A甲基化組。目前對于 mRNA上m1A 修飾的研究仍然處于起步階段，例如5′UTR的m1A甲基轉(zhuǎn)移酶，m1A修飾參與RNA代謝調(diào)控的具體分子機制，m1A修飾是否像m6A修飾一樣在多個生物學(xué)過程中發(fā)揮調(diào)控作用等都有待未來進行深入的研究。

綜上所述，以m6A為代表的RNA修飾在RNA加工及生命過程中扮演著重要的調(diào)控作用(表1)。隨著研究的深入及先進技術(shù)的開發(fā)，RNA 修飾調(diào)控基因表達的生物學(xué)過程與機制一定會更加清楚。