腫瘤研究|從組織處理、培養(yǎng)到鑒定分析

2020.11.25

那么在對(duì)腫瘤細(xì)胞的研究中，我們最常遇到的難題包括哪些呢？首先從腫瘤組織中獲得細(xì)胞的第一步就是制備單細(xì)胞懸液，目前一般使用消化酶來消化腫瘤組織。其中包括消化酶的選擇、消化的時(shí)間、是否需要去除紅細(xì)胞等都是在實(shí)驗(yàn)操作中值得我們注意的地方。其次，在進(jìn)行細(xì)胞系培養(yǎng)的過程中，如何培養(yǎng)出更具有生理相關(guān)性的腫瘤細(xì)胞才能更好地達(dá)到我們的研究目的？除此之外，怎樣鑒定我們得到的細(xì)胞是目的腫瘤細(xì)胞呢？針對(duì)這些問題，今天這一期推文我們來具體聊一聊。

從腫瘤組織制備單細(xì)胞懸液

下述操作步驟適用于乳腺癌（4T1）、黑色素瘤（B16-F10）和結(jié)腸癌（CT26.WT）的小鼠模型的實(shí)體瘤或人乳腺癌和卵巢癌組織。若您使用的是其它腫瘤組織，消化步驟需進(jìn)一步優(yōu)化，詳情請(qǐng)咨詢我們的技術(shù)支持。

實(shí)驗(yàn)步驟

該步驟中所用的試劑體積適用于處理少于1.0g的腫瘤組織。若您需要處理大于1.0g的腫瘤組織，請(qǐng)適當(dāng)調(diào)整體積。

1. 混合以下試劑，以制備5 mL的腫瘤組織消化液：

- 500 μL膠原酶/透明質(zhì)酸酶溶液（產(chǎn)品號(hào) #07912）

- 750 μL DNase I溶液（1 mg/mL；產(chǎn)品號(hào) #07900）

- 3.75 mL RPMI 1640培養(yǎng)基（產(chǎn)品號(hào) #36750）

充分混勻并預(yù)熱至室溫（15 - 25°C）；

2. 將腫瘤組織收集到35 mm培養(yǎng)皿（產(chǎn)品號(hào) #27100）中，用剪刀或手術(shù)刀將腫瘤組織切碎成小塊（≤ 2 mm）；

3. 將剪碎的腫瘤組織轉(zhuǎn)移至14 mL圓底管（產(chǎn)品號(hào) #38008），并加入步驟1中混勻的消化液；

4. 在37°C搖床，90 rpm，孵育25分鐘；

5. 將70 μm細(xì)胞過濾器（產(chǎn)品號(hào) #27260）置于50 mL無菌錐形管（產(chǎn)品號(hào) #38010）上，并使用推薦溶液（EasySep?緩沖液，產(chǎn)品號(hào) #20144，或含2%FBS和1 mM EDTA的PBS。注意溶液不含Ca 和Mg ）潤洗濾網(wǎng)；

6. 將4中充分孵育的腫瘤組織混合液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至潤洗過的70 μm細(xì)胞過濾器，使用無菌注射器的活塞/柱塞，以溫和畫圓的方式使細(xì)胞和組織通過濾網(wǎng)。接著使用推薦溶液沖洗濾網(wǎng)并將其收集至同一錐形管中，最后使用推薦溶液將錐形管中溶液體積補(bǔ)充至50 mL；

7. 室溫下300 x g，離心10分鐘，小心去除上清液；

注意：離心過程中將離心機(jī)設(shè)置為緩慢加速和減速。

8. 在收集的細(xì)胞中加入10 mL氯化銨溶液（產(chǎn)品號(hào) #07800），室溫下孵育5分鐘；

注意：此步驟是為了去除紅細(xì)胞。對(duì)于一些無需去除紅細(xì)胞的腫瘤組織，可忽略8、9步驟。

9. 加入推薦溶液至50 mL，室溫下300 x g，離心10分鐘，小心去除上清液；

注意：離心過程中將離心機(jī)設(shè)置為緩慢加速和減速。

10. 對(duì)于人的腫瘤組織，將細(xì)胞按1 x 10^8 cells/mL的濃度重懸于推薦溶液中；對(duì)于小鼠的腫瘤組織，將細(xì)胞按5 x 10^7 cells/mL的濃度重懸于推薦溶液中。

注意：若需要從小鼠腫瘤中獲得更高純度的TIL，可將細(xì)胞按5-10 x 10^7 cells/mL濃度重懸；若需要獲得更多的TIL，即回收率更高，可按1-2.5 x 10^7 cells/mL濃度進(jìn)行重懸。

腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)

傳統(tǒng)的2D貼壁細(xì)胞培養(yǎng)模型由于缺乏體內(nèi)組織微環(huán)境導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)與體內(nèi)存在顯著差異，從而導(dǎo)致藥物響應(yīng)模式及信號(hào)分子通路的表達(dá)與生物體內(nèi)顯著不同。而3D細(xì)胞腫瘤球可以通過模擬三維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，更貼近腫瘤組織相應(yīng)的病理生理特征。目前3D腫瘤球培養(yǎng)模型已經(jīng)逐漸應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)和分化、癌癥研究、藥物和毒性篩選等特定應(yīng)用中。

STEMCELL的AggreWell?培養(yǎng)板（產(chǎn)品號(hào) #34460）即可進(jìn)行細(xì)胞的3D培養(yǎng)，通過它可輕松生成大小均一的3D腫瘤球（圖1），并且適用于多種腫瘤細(xì)胞類型，包括乳腺癌[1]，前列腺癌[2]，結(jié)腸癌[2]，肝癌[3,4]，小膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系[5]等。

圖1. 使用AggreWell?生成的腫瘤球大小、形態(tài)均一

（A）結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29（B）前列腺癌細(xì)胞系LNCap（C）食管癌細(xì)胞系TE6。所有細(xì)胞球都按每微孔100個(gè)細(xì)胞的密度鋪板。放大倍數(shù)為10X。圖片由卡爾加里大學(xué)的Golsa Razian和Mark Ungrin友情提供。

腫瘤干細(xì)胞的鑒定

腫瘤干細(xì)胞（Cancer Stem Cell, CSC）是一種獨(dú)特的腫瘤細(xì)胞亞群，具有類似干細(xì)胞的自我更新、多能分化和無限增殖的能力。CSCs已被廣泛認(rèn)為是癌癥進(jìn)展、復(fù)發(fā)、治療耐藥以及轉(zhuǎn)移的原因。不同腫瘤的CSC具有不同的表面標(biāo)志物，比如CD133 、CD44 CD24-等[6]。此外，還可以用檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)乙醛脫氫酶（ALDH）活性的方法來檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞。

ALDH的活性已經(jīng)被證實(shí)在多種組織中可以作為具有干細(xì)胞特性的惡性細(xì)胞的有用標(biāo)志物。在多發(fā)性骨髓瘤和急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）[7-9]、前列腺癌[10]、結(jié)腸癌[11,12]、頭頸癌[13,14]、甲狀腺癌[15]、乳腺癌[16-18]、肝癌[19]、卵巢癌[20]、宮頸癌[21]、膀胱癌[22]、腦癌[23]和肺癌[24]中，都發(fā)現(xiàn)了ALDH的表達(dá)增加。也有研究顯示，ALDH表型與多種癌癥的不良預(yù)后結(jié)果有關(guān)[18,25,26]。ALDH的活性是通過ALDEFLUOR?（產(chǎn)品號(hào) #01700），一種非免疫的熒光試劑來檢測(cè)的，已被超過1000篇文獻(xiàn)所引用。查看以下視頻，了解ALDEFLUOR?檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞的技術(shù)原理。