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上周六，趙老師和大家分享的是免編程學(xué)生信--尋找差異分子案例實(shí)踐--富集分析，并現(xiàn)場(chǎng)解答群友提出的相關(guān)提問(wèn)（qq群463367325）。

菜鳥(niǎo)不會(huì)編程，clusterProfiler不能速成，著急要做富集分析怎么辦？上周六的沙龍直播解決了這個(gè)問(wèn)題，趙老師操作演示了怎樣用免編程的工具David做富集分析，并現(xiàn)場(chǎng)解答群友提出的相關(guān)提問(wèn)（qq群463367325），零基礎(chǔ)的菜鳥(niǎo)入門(mén)必看~

（David太low想用R做富集分析？點(diǎn)這里看clusterProfiler。開(kāi)發(fā)者Y叔明晚直播，點(diǎn)這里參加。）

(* ￣3)(ε￣ *)感謝可愛(ài)的熱心群友和小編編~ 盡管視頻制作出了一點(diǎn)小意外，在大家的努力下視頻可以照常領(lǐng)取。

發(fā)送 GSNX 到后臺(tái)，馬上得全套現(xiàn)場(chǎng)課程+答疑視頻，開(kāi)始小白的歷練之路吧~

最近提過(guò)問(wèn)題但錯(cuò)過(guò)現(xiàn)場(chǎng)答疑的同志，仔細(xì)看推送中有沒(méi)有自己的提問(wèn)，領(lǐng)到錄像好好學(xué)習(xí)……

要是有追問(wèn)，可以組織語(yǔ)言在群里求助（提問(wèn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀這篇求助得回應(yīng)秘訣），如果沒(méi)有解答，周六統(tǒng)一直播回答。點(diǎn)這里查看優(yōu)質(zhì)提問(wèn)的示例~

發(fā)送到有道云筆記的優(yōu)質(zhì)提問(wèn)將獲得專(zhuān)場(chǎng)解答，將問(wèn)題寫(xiě)在有道云筆記里，進(jìn)qq群463367325，把有道云筆記鏈接私信發(fā)給小覓0號(hào)（點(diǎn)這里看歐陽(yáng)同學(xué)整理的有道云使用心得）。

問(wèn)答版與現(xiàn)場(chǎng)答疑內(nèi)容僅供參考，并非標(biāo)準(zhǔn)答案，歡迎大家深入思考，提出不同的見(jiàn)解?；仡櫷莆牡膬?nèi)容排序即現(xiàn)場(chǎng)直播課程順序，先領(lǐng)視頻，再對(duì)照回顧推文看視頻，學(xué)習(xí)效果好：）

問(wèn):蛋白質(zhì)序列分析里面，有抗原表位預(yù)測(cè)分析。有什么好的方法？

如果用Bcepred或者Protean程序或者服務(wù)器進(jìn)行分析怎么解讀預(yù)測(cè)的結(jié)果？、

這里我以HCV 1b型的core蛋白為例。在NCBI進(jìn)行蛋白質(zhì)搜索HCV 1b的core蛋白。

截圖如下：

搜索

選擇紅框內(nèi)

選擇Protein

在檢索框內(nèi)輸入下面的檢索式的后面部分（AND之后的部分）
檢索式：txid31647[Organism:noexp] AND core NOT partial

這里我們得到264條命中條目，我怎么知道他們的區(qū)別呢？怎樣才能選出我需要分析的那幾個(gè)病毒株的蛋白？

這里我按照GI號(hào)得到想要的病毒株的蛋白，GI:149389442（中國(guó)湖北株）, GI:156914952（中國(guó)河北株）, GI:169259719（美國(guó)德州株）, GI:169244832（美國(guó)馬薩諸塞州株）, GI:169244808（瑞士株）, GI:169259719（德國(guó)株）。

我把GI:149389442（中國(guó)湖北株）對(duì)應(yīng)的.fasta文件導(dǎo)入到DNASTAR的Protean程序打開(kāi)，得到結(jié)果如下：

軟件：

結(jié)果如下：

我怎么指導(dǎo)預(yù)測(cè)到的抗原表位對(duì)應(yīng)的肽鏈片段在哪一個(gè)位置？里面氨基酸排列的順序是怎樣的？

問(wèn)題比較啰嗦，謝謝趙老師。趙老師要是能推薦更好更方便的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)抗原表位的軟件就更好了。

趙忻藝錄像中已經(jīng)回答

問(wèn)(留言板):如何用已知的靶基因預(yù)測(cè)LncRNA??？

趙忻藝部分文字回答：順和反式靶基因預(yù)測(cè)。

問(wèn):教一下，用SRAtoolkit怎么將SRA文件轉(zhuǎn)化為fastq文件格式?

趙忻藝部分文字回答：詳細(xì)看說(shuō)明書(shū)或百度。

問(wèn):請(qǐng)教，用geo2r分析的結(jié)果為什么和原文差那么多？多了好多好多的基因。

趙忻藝部分文字回答：可能是閾值和差異統(tǒng)計(jì)算法不同。

問(wèn):請(qǐng)教兩個(gè)關(guān)于TCGA 里面編號(hào)的問(wèn)題~    樣本編號(hào) 01 -09 指代的是腫瘤組織  11-19指代的是正常組織。 20-29指代的是什么??？

還有02指代的是什么？    

TCGA code table report 登陸不上去 沒(méi)辦法查了……

趙忻藝部分文字回答：見(jiàn)往期問(wèn)題 http://mp.weixin.qq.com/s/42bsqnaD2MSpCa5qwG6H8g（點(diǎn)鏈接直達(dá)）

問(wèn):請(qǐng)問(wèn)人類(lèi)基因組的gff3文件從哪下載呢？

答：可以從ucsc的table browser下載。

問(wèn):請(qǐng)問(wèn)，R可以實(shí)現(xiàn)用bootstrap方法，計(jì)算ROC曲線(xiàn)auc, se等統(tǒng)計(jì)量以及置信區(qū)間的代碼么？發(fā)SCI可合作。謝謝大神們

答：可以

趙忻藝部分文字回答：http://mp.weixin.qq.com/s/_I4Pu1Re0C5jtc6BWE9t9g（點(diǎn)鏈接可直達(dá)）

問(wèn)：請(qǐng)問(wèn)，GEO上SRP是什么數(shù)據(jù)？

答：可能是實(shí)驗(yàn)備注

趙忻藝部分文字回答：不是實(shí)驗(yàn)備注，是測(cè)序數(shù)據(jù)

問(wèn):GEO上能下載基因芯片的CEL文件，請(qǐng)問(wèn)哪里下載基因芯片的CDF文件和Probe文件？

趙忻藝部分文字回答：平臺(tái)信息

問(wèn):比如同一芯片，兩個(gè)研究，一個(gè)在中國(guó)20癌20癌旁，一個(gè)研究在美國(guó)一個(gè)癌12，正常組織9也是要分開(kāi)分析差異基因再找overlab值嗎。

趙忻藝部分文字回答：是的

問(wèn):請(qǐng)教下，測(cè)序深度=reads長(zhǎng)度×比對(duì)的reads數(shù)目/ 參考序列長(zhǎng)度這個(gè)公式怎么理解呢？reads什么意思??？是不是fastq文件中的一行啊？

答：read就是測(cè)序片段（小片段）

趙忻藝部分文字回答：是的，fastq打開(kāi)是4行一個(gè)read。

問(wèn):參考序列長(zhǎng)度是啥啊

趙忻藝部分文字回答：全基因組大小。

問(wèn):gencode中current release與reference release有啥不同？

趙忻藝部分文字回答：版本不同

問(wèn):各位大神，我在做差異基因表達(dá)時(shí)候，運(yùn)行 fit<>時(shí)，Error in lmFit(rt, design) : row dimension of designdoesn't match column dimension of data object，有誰(shuí)見(jiàn)過(guò)嗎？
趙忻藝部分文字回答：交代不明。截圖需截清楚。

問(wèn):圖中的p value ,t test,FC 是自己算的么，還是數(shù)據(jù)庫(kù)就可顯示？

趙忻藝部分文字回答：圖上已顯示

問(wèn):各位有遇到過(guò)這種情況的嗎？為什么我無(wú)法導(dǎo)入這個(gè)CEL文件到genespring里？

趙忻藝部分文字回答：無(wú)法識(shí)別（原因很多），采用萬(wàn)能導(dǎo)入法，見(jiàn)往期視頻。

問(wèn):

老師你好，今晚的課，我準(zhǔn)備提以下問(wèn)題。

1.有的geo芯片原始數(shù)據(jù)過(guò)于龐大，超過(guò)20個(gè)G,這種情況下可否就使用平臺(tái)矩陣文件，導(dǎo)入genespring。

趙忻藝部分文字回答：可以的。

2.平臺(tái)矩陣文件導(dǎo)入是否與原件導(dǎo)入不同？因?yàn)槠脚_(tái)矩陣除了多余行，有的還列出樣本臨床信息。

趙忻藝部分文字回答：不是，矩陣一般是標(biāo)準(zhǔn)化后的了

3.tcga數(shù)據(jù)庫(kù)可否也用genespring 分析，可否請(qǐng)老師單獨(dú)列為一課教授，謝謝。

趙忻藝部分文字回答：如果是求差異基因，從算法是可以的，但RNA-seq數(shù)據(jù)文章一般采用專(zhuān)門(mén)的軟件DEseq。

問(wèn):請(qǐng)教個(gè)問(wèn)題，趙老師講genespring是，導(dǎo)入的矩陣和平臺(tái)注釋信息時(shí)提前需要處理，請(qǐng)問(wèn)具體怎么處理的，謝謝。

答（趙忻藝浙大生信）：把標(biāo)題的注解刪掉。

問(wèn)：謝謝老師，是矩陣數(shù)據(jù)整理成這樣嗎？平臺(tái)注釋信息打不開(kāi)，一直是沒(méi)反應(yīng)

問(wèn):

這是矩陣數(shù)據(jù)的形式，能整理成老師講課時(shí)的形式，但平臺(tái)注釋信息打不開(kāi)的問(wèn)題沒(méi)解決，是哪個(gè)地方我沒(méi)注意嗎？謝謝。我?guī)熃阕鲞^(guò)網(wǎng)絡(luò)的meta, 你做的是二分類(lèi)還是連續(xù)變量的

答（趙忻藝 浙大 生信）：就是這樣可以的

問(wèn):

請(qǐng)問(wèn)技術(shù)名稱(chēng)怎么填，什么含義，國(guó)慶期間看的趙老師推文，因不是生信專(zhuān)業(yè)，所以問(wèn)題有些多，麻煩大家了

趙忻藝部分文字回答：見(jiàn)往期視頻操作

問(wèn):

請(qǐng)問(wèn)一下老師和各位小伙伴，我用R語(yǔ)言做出來(lái)的差異基因表格中，一個(gè)基因?qū)?yīng)多個(gè)探針，我想取平均值或者最大值，但是具體函數(shù)包不會(huì)調(diào)用，可以賜教一下嗎

答:直接取最大值快一點(diǎn)吧。

問(wèn):我現(xiàn)在已經(jīng)得到差異基因表了，用什么函數(shù)取重復(fù)基因的最大值呢

答：先order一下  然后去duplicated，根據(jù)rowsum   order

答（趙忻藝）：你可以在excel中，排序再刪除重復(fù)項(xiàng)。

問(wèn):老師，差異基因表里面的數(shù)目比較多，我試過(guò)您這種辦法，貌似刪除下來(lái)挺多步驟的。

答（趙忻藝）：不多，幾秒就好了。

問(wèn):我已經(jīng)排好序了，我手動(dòng)刪除嗎？有2469個(gè)差異基因呢。

答（趙忻藝）：刪除重復(fù)項(xiàng)，有按鈕的。

問(wèn):謝謝老師，已經(jīng)刪除了，但是留下來(lái)的基因，對(duì)應(yīng)的表達(dá)值，應(yīng)該是隨機(jī)的吧，這樣就不存在平均值或者最大值了。

答（趙忻藝）：你排過(guò)序，他就保留最大了，即保留第一個(gè)。

問(wèn):老師，我是按照gene那一欄直接剔除重復(fù)項(xiàng)，如圖兩張前后示，但是還是沒(méi)有保留最大值，您說(shuō)的排過(guò)序，是什么意思呢？

答（趙忻藝）：根據(jù)值排序。

問(wèn)：根據(jù)值排序，然后對(duì)gene欄進(jìn)行刪除重復(fù)嗎?表達(dá)值排序好像沒(méi)有哎，我先把AveExpr升序了，然后點(diǎn)擊刪除重復(fù)數(shù)據(jù)，按照指示刪除gene中的重復(fù)數(shù)據(jù)，依舊沒(méi)有保留最大值，請(qǐng)問(wèn)老師，我的問(wèn)題出在哪兒呢

答（趙忻藝）：刪除它保留第一個(gè)，只要你第一個(gè)是最大值就行。所以讓你排序。

問(wèn):哦哦，我知道原因了，應(yīng)該是把我的表達(dá)值降序來(lái)排。

謝謝老師，可是對(duì)于這種gene中好幾個(gè)基因名字的，老師你們是直接剔除掉嗎？

答（趙忻藝）：可以保留，這個(gè)無(wú)所謂

問(wèn):謝謝老師，需要多多跟您學(xué)習(xí)，對(duì)了，我考慮不保留重復(fù)的原因之一是，在我們做KEEG和GO分析的時(shí)候，是不是需要剔除好些呢？

答（趙忻藝）：做KEGG時(shí)已經(jīng)剔除重復(fù)的了。

問(wèn):在freescience聯(lián)盟公眾號(hào)的文章“實(shí)踐（六）—多類(lèi)型芯片數(shù)據(jù)整合分析”里寫(xiě)的“如果對(duì)實(shí)現(xiàn)這流程有興趣的鞋童可以加入到freescience微信群進(jìn)行學(xué)習(xí)與交流，操作中的具體流程和文件都可以下載哦。。。”請(qǐng)問(wèn)具體流程和文件在哪里下載呢，謝謝.

同時(shí)還想請(qǐng)問(wèn)能不能給兩三個(gè)示例文件，這樣我可以看表格是怎么排布的，比如第一列是gene symbol，第二列是p值，第三列是fold change之類(lèi)的，這樣我可以把我的數(shù)據(jù)按格式排列好。

答：這個(gè)演示里面有啊，genespring，只有整合不同來(lái)源的數(shù)據(jù)時(shí)就不能只用genespring

問(wèn)：就是要不同來(lái)源的

答：你下的gse數(shù)據(jù)就是表格,那你自己去下不同平臺(tái)的打開(kāi)看不就可以了嗎.

趙忻藝部分文字回答：以后講解。

問(wèn):請(qǐng)問(wèn)大家，r包運(yùn)行后生成在globalenviroment中變量能導(dǎo)出嗎？

答：找到方法了，似乎用，write.matrix可以直接導(dǎo)出。謝謝。

問(wèn):

請(qǐng)問(wèn)：我用過(guò)r包c(diǎn)lusterprofiler和david做過(guò)比較，大多數(shù)情況clusterprofiler挺好的，但有一次得到的結(jié)果，david有我想要的，但clusterprofiler里沒(méi)有，這種情況是什么原因造成的？是不是q-value多重假設(shè)檢驗(yàn)的方式不一樣？

趙忻藝錄像中已回答

通過(guò)往期介紹，當(dāng)我們從基因芯片的大數(shù)據(jù)中尋找到幾千或幾百個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)和表達(dá)上差異的分子后如何解釋這些結(jié)果或者說(shuō)最終得到一個(gè)基因列表能告訴我們什么呢？從中能給我們什么提示？能下什么結(jié)論呢?

這里就要介紹一種分析方法就是富集分析了。首先不少人經(jīng)常會(huì)有這樣一個(gè)疑問(wèn)——僅僅一個(gè)基因列表又怎么能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析呢？又沒(méi)有對(duì)照，怎么計(jì)算p值呢？

這里舉個(gè)例子：在一個(gè)廣場(chǎng)上從早上到晚上都有著各種活動(dòng)，早上5-6點(diǎn)有老人在鍛煉身體，7-8點(diǎn)廣場(chǎng)上開(kāi)始有小販、游客和行人，到了下午有不少青年人舉行商業(yè)促銷(xiāo)活動(dòng)，傍晚廣場(chǎng)就是屬于廣場(chǎng)舞大媽?zhuān)砩弦瓜艡n四起。那么當(dāng)我們?cè)诓恢罆r(shí)間的情況下，抽取廣場(chǎng)100個(gè)人，是否能從這百人的列表推測(cè)出廣場(chǎng)上正在進(jìn)行的活動(dòng)或者時(shí)間呢？當(dāng)100人群中有80%的人是大媽?zhuān)磕敲磸V場(chǎng)上進(jìn)行什么活動(dòng)在什么時(shí)間就顯而易見(jiàn)吧。

那么人換成基因也是同理的。首先要定義基因集(geneset)， 也就是基于我們的先驗(yàn)知識(shí)（基因組注釋信息）。將基因富集可以想象成代表某一功能活動(dòng)的群體，每個(gè)個(gè)人可能同時(shí)參與好幾種功能活動(dòng)，我們所分析的不是單個(gè) 個(gè)體的差異，而是實(shí)際群體和期望功能群體是否有差異，從而推測(cè)出此時(shí)此刻發(fā)生了什么事，在這些事件中哪些個(gè)體又起到了什么作用。

基因注釋信息根據(jù)通路數(shù)據(jù)庫(kù)例如KEGG，那么就是通路（Pathway）富集分析，如果根據(jù)GeneOntology包含分子功能（MolecularFunction），生物過(guò)程（biologicalprocess）和細(xì)胞組成（cellularcomponent）三個(gè)部分來(lái)注釋?zhuān)蔷褪荊O功能富集分析。這樣大家對(duì)富集分析有所理解了吧，當(dāng)然其中會(huì)涉及到統(tǒng)計(jì)方法例如fisher精確概率，GSEA，PACE，一般選用以上一種方法進(jìn)行即可。

以下是還原文獻(xiàn)中Onto-Tools進(jìn)行的功能富集分析描述。（PMID: 25712376）

Functional analysis
To evaluate thepotential functions of the gene list, we performed ontological analysis of DEgenes. The Onto-Express (OE) (http://vortex.cs.wayne.edu/ontoexpress), a web-based program, was used to perform the gene ontology (GO)enrichment analysis using hypergeometric tests. The pathway was analyzed by theKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) http://www.genome.ad.jp/), as well as by Pathway-Express, another application in the Onto-Toolsdatabase.

接下來(lái)對(duì)其實(shí)現(xiàn)過(guò)程進(jìn)行實(shí)操：

首先在于全局性地了解這些差異分子可能影響到生物功能，提供新的研究方向。其次，縮小了研究范圍，從幾千幾百個(gè)差異分 子到幾十個(gè)功能通路富集的重要分子。最終驗(yàn)證和解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如果通路分析和預(yù)期功能實(shí)驗(yàn)相符，那就能從分子水平上進(jìn)一步驗(yàn)證和解釋功能現(xiàn)象。

本期就到這里了，相信大家對(duì)富集分析已經(jīng)有所了解了。下期將進(jìn)一步學(xué)習(xí)一個(gè)更簡(jiǎn)單，易操作的在線(xiàn)分析工具David，這個(gè)工具廣泛地被應(yīng)用到通路析和GO功能富集分析中。