山中伸彌（Shinya Yamanaka）獲得諾獎已經有幾天了，雖然兩年前在聽完他的講座后我興致很高地寫了兩篇博客，這些天我卻沒有多少動力再寫一篇完整的文章來介紹他的工作。

我一直對中國現在還盛行的規(guī)劃性科研，應用導向型科研耿耿于懷。這些所謂的重大項目在立項的當初對目標/前景寫得宏大無比，之后卻通常草草收場。如果那些重大項目真的能實現立項當初的用意，那諾貝爾獎早就在中國遍地開花了。廣大科研人員都覺得這種運行模式是一個笑話，饒毅、施一公等大牛也重炮轟擊，但是分錢游戲還在進行著。而公眾，包括相當一部分科研人員也并不了解科研的自身規(guī)律，總是一再地問做基礎研究有什么用。

Shinya Yamanaka的成功是典型的小實驗室自由探索的成功。他的成功再一次提示，有相當多的科學突破是不可預測的。如果中國有大批優(yōu)質的小實驗室得到穩(wěn)定的資助，那么類似的科學突破就會隨機但是必然地產生。從這種意義上講，展示Shinya Yamanaka在研究過程中的這種隨機性和必然性，向公眾科普科研活動是如何進行的，是值得我花一點時間的。

解析Shinya Yamanaka發(fā)現誘導干細胞（iPS）的來龍去脈比較簡單，就是跟蹤他順次研究的基因: ApoBEC1-Nat1-Fbx15，最后發(fā)現iPS。有趣的是他在順次研究這些基因的時候轉了兩次方向：ApoB是血脂蛋白，研究它的剪切酶（或者叫編輯酶）ApoBEC1是為了調節(jié)血脂，但是卻發(fā)現ApoBEC1過表達的小鼠得了肝癌；為了研究致癌機理，他找到ApoBEC1的下游蛋白Nat1，Nat1的敲除導致小鼠在胚胎期死亡，以及胚胎干細胞在體外無法分化；于是他又開始研究起胚胎干細胞，找到許多胚胎干細胞特異表達的基因，其中之一是Fbx15，最后用Fbx15敲除鼠建立assay（篩選方法/系統(tǒng)），幸運地篩選出了iPS。

整形外科到博士階段

Shinya Yamanka念高中時迷上柔道，因為受傷經常上醫(yī)院，他在爸爸的建議下隨后考入國立神戶大學醫(yī)學部，準備以后做一名整形外科醫(yī)生。大學畢業(yè)做臨床實習期間，他發(fā)現自己對手術其實沒有什么天分，別人做20分鐘的手術他兩個小時也未必完成；并且他覺得做醫(yī)生再優(yōu)秀也只能幫助少數的病人，而醫(yī)學研究有成果的話通常可以幫助更多的病人，所以他的興趣轉向基礎醫(yī)學研究。在大阪市立大學博士期間，Shinya的主要工作是研究血壓調節(jié)的分子機理[1, 2]。在研究過程中，Shinya對小鼠基因敲除和轉基因技術感到震驚，于是他在申請博士后位置的時候聯(lián)系的都是利用這些技術的實驗室。

博士后階段-ApoBEC1

這位失敗的整形醫(yī)生最后被加州Gladstone Institute的Thomas Innerarity納入門下（圖一）。Thomas實驗室研究的是血脂調節(jié)，跟Shinya博士期間的工作有點關系。Shinya的新課題是研究ApoB mRNA的剪切蛋白ApoBEC1。

ApoB是低密度脂蛋白的主要構成成分。ApoB mRNA可以被剪切酶ApoBEC1剪切，形成兩種不同大小的蛋白：全長的ApoB100和大約一半長的ApoB48。經過剪切后的ApoB48在血漿中會被迅速清除。Thomas預測，如果在肝臟中過表達ApoBEC1，那么血脂就可能降低；如果這個模型可行的話，也許未來通過基因療法可以幫助一些肥胖病人降低血脂。

Shinya一周七天地勤奮工作，花了六個月做成了轉基因鼠。有一天早上，幫他維護小鼠的技術員告訴他：Shinya，你的許多小鼠都懷孕了，可是小鼠是公的。Shinya說你不是跟我開玩笑吧。他到老鼠房一看，果真有很多公鼠看起來懷孕了。他殺了其中幾只，發(fā)現原來是小鼠得了肝癌，肝臟腫大撐大了肚皮。

ApoBEC1過表達后低密度脂蛋白是降低了，但是高密度脂蛋白卻升高了，同時還得了肝癌，這買賣不合算啊[3]。Shinya在一次講座中總結了其中的經驗教訓：其一，科學是不可預測的；其二，不要嘗試在病人身上做新基因的治療；其三，也許最重要的是，不要相信導師的假說。

Thomas對結果不能符合預期很失望，但是這個預想之外的結果卻引起了Shinya的好奇：究竟是什么機理使小鼠得腫瘤的呢？好在Thomas足夠開明，他允許Shinya偏離實驗室的主要方向，繼續(xù)探索ApoBEC1的致癌機理?？梢韵胍姡?/font>ApoBEC1過表達以后也可能會剪切ApoB之外的其它mRNA，找到這些mRNA也許可以解釋ApoBEC1為什么能致癌。

由于已知ApoBEC1需識別底物mRNA的特異序列才能剪切，Shinya據此設計引物擴增，找到了ApoBEC1的一個新底物-抑制蛋白翻譯的基因Nat1。ApoBEC1過表達后，Nat1蛋白消失[4]。從邏輯上講，如果剪切Nat1是導致ApoBEC1致癌的重要分子，那么Nat1敲除的小鼠也會長癌。

圖一：憶往昔青澀頭發(fā)稠。Shinya Yamanaka和他的導師Thomas Innerarity在Gladstone Institute實驗室 [15]

基因敲除比起轉基因要更加復雜，需要把構建的質粒原位整合到體外培養(yǎng)的胚胎干細胞中?；蚯贸夹g不就是Shinya博士階段做夢都想學的技術嗎？于是Shinya找到所里做基因敲除的專家，當時還是助理教授的Robert Farese，從他的助手Heather Myers那里學了這項技術的每個細節(jié)，并成功地獲得了Nat1敲除的雜合鼠。Heather Myers是Shinya的終生好友；Shinya發(fā)現iPS以后，也公開表達了對Heather Myers的感激，因為是她告訴Shinya，胚胎干細胞不僅僅是做敲除小鼠的手段，其本身也可以是非常有趣的研究對象。

在Shinya興致勃勃地繼續(xù)追問Nat1的功能時，他的妻子帶著女兒離開他回到了日本。半年后他決定中斷研究帶著三只珍貴的Nat1雜合鼠，也跟隨家人回國。

大阪的毛毛蟲階段-Nat1

憑借他在博士后期間發(fā)表的四篇高質量的一作論文，1996 年Shinya在母校大阪市立大學找到了助理教授的職位，繼續(xù)他的Nat1研究。

再一次地與預測出現偏差：Nat1敲除后，純合子小鼠在胚胎發(fā)育早期就死了，根本無法觀察到成鼠是否得腫瘤。Shinya進一步研究發(fā)現，敲除Nat1的胚胎干細胞在體外根本不能像正常干細胞一樣分化[5]。此時他想起了Heather Myers的話：胚胎干細胞不僅是研究的工具，它本身也可以是非常有趣的研究對象。他的關注點開始轉移到胚胎干細胞上來。

在剛回大阪的頭幾年，Shinya由于剛起步，只能得到少量的研究資助，他不得不自己一個人養(yǎng)幾百只小鼠，日子過得非常艱苦。同時大阪市立大學醫(yī)學院的基礎研究很薄弱，周圍的人不理解Shinya研究Nat1在胚胎干細胞中的功能有什么意義，總是勸說Shinya做一些更靠近醫(yī)藥臨床方面的研究。而Nat1的研究論文提交給雜志后一直被據稿。種種壓力與不得志，Shinya因之得了一種病叫PAD（Post America Depression，離開美國后的抑郁癥；自創(chuàng)的玩笑話），幾乎要放棄科研回鍋做整形醫(yī)生。

在他最低谷的時候，有兩件事情把他從PAD中挽救了回來。其一是James Thomson（俞君英的導師，1997年幾乎與Shinya同時宣布做出了人的iPS） 在1998年宣布從人的囊胚中采集并建立了胚胎干細胞系：這些干細胞在體外培養(yǎng)幾個月后還可以分化成不同胚層的細胞，比如腸上皮細胞，軟骨細胞，神經上皮細胞等[6]。這給了Shinya巨大的鼓舞，他開始更加堅信胚胎干細胞研究是有意義的，將來必然有一天會用于臨床。第二件事是條件更加優(yōu)越的 奈良先端科學技術研究生院看上了他的特長，招聘他去建立一個做基因敲除小鼠的facility（中心？設施？），并給他提供了副教授的職位。

奈良的成蛹階段-Fbx15

千辛萬苦脫了幾層皮后，Shinya終于擁有了自己獨立的實驗室。第一次可以招幫手，好爽啊。但是問題又來了：研究生的生源是有限的，學生會傾向于選擇資歷更老條件更好的實驗室，而不一定會選擇剛起步的實驗室；你想招但人家不來啊。為了吸引學生到他實驗室，Shinya冥思苦想了好一陣，提出了一個雄心勃勃的計劃，聲稱實驗室的遠景目標是研究怎么從終末分化的成體細胞變回多能的干細胞。

當時科學界的主流是研究怎么把胚胎多能干細胞分化成各種不同組織的細胞，以期用這些分化的功能細胞取代受損的或者有疾病的組織細胞。Shinya認為自己的實驗室沒有實力跟這些大牛競爭，那不如反其道而行之，研究怎么從分化的細胞逆轉為多能干細胞。

當時科學界的主流觀點認為，哺乳動物胚胎發(fā)育過程中的細胞分化是單向的，就像是時間不可逆轉。這個觀點也并非沒有破綻，比如植物組織就具有多能性，一些植物的莖插入土壤會重新長出一棵植株，也即已經分化的莖細胞可以改變命運分化出新的根莖葉細胞。而早在1962年，也即Shinya出生的那一年，英國的John Gurdon爵士（與Shinya共享諾貝爾獎）報道了他的驚人發(fā)現：把蝌蚪的腸細胞核移植到去核的蛙卵中，新細胞可以發(fā)育成蝌蚪[7]。進一步地，為了說服人們接受終末分化的細胞核也具有全能性，他利用相同的轉核技術，用成蛙的細胞核發(fā)育出蝌蚪，用胚胎期分化的細胞核發(fā)育出了可生育傳代的成蛙[8, 9]。1997年，Ian Wilmut和Keith Campbell基于同樣的原理，把羊的乳腺細胞核移植到去核的羊卵中，成功地培育出了克隆羊多莉[10]。2001年，科學家發(fā)現，通過與 干細胞融合，胸腺細胞核獲得了很大程度的重編程[11]。

Shinya計劃的第一步是找到盡可能多的，類似于Nat1參與維持干細胞功能的因子（維持因子的意思是這些因子是胚胎干細胞在體外培養(yǎng)維持多能性所必需的）。他大膽推測，如果過表達這些維持因子也許可以讓終末分化的細胞變回多能干細胞。一旦成功，誘導的多能干細胞會有著胚胎干細胞所不具備的優(yōu)勢：它不僅可以繞開胚胎干細胞引起的倫理問題，病人本身的誘導干細胞改造后重新植入病人時，由于是自身的細胞，將不會有免疫排斥的難題。

在這個遠大前景的感召下，Shinya果然“忽悠”了三個學生加入他實驗室。很快地，他們鑒定出一系列的在胚胎干細胞特異表達的基因。其中一個基因就是Fbx15。Shinya的學生Yoshimi Tokuzawa發(fā)現Fbx15除了特異表達于胚胎干細胞外，它還能被另外兩個胚胎干細胞維持因子Oct3/4和Sox2直接調控。Shinya跟Yoshimi說：Fbx15應該參與維持干細胞多能性和胚胎的發(fā)育，我猜你沒有辦法得到Fbx15敲除的純合鼠。Yoshimi構建質粒做了基因敲除小鼠，把染色體上的Fbx15基因通過同源重組替換成抗G418藥物的基因neo。

復雜的生命又一次愚弄了Shinya：Fbx15敲除的純合鼠活得很健康，沒有顯見的表型。Shinya又挑戰(zhàn)他的學生說：好吧，Fbx15也許不是小鼠胚胎發(fā)育所必需的，但是它應該是維持體外胚胎干細胞所必需的，我打賭你沒有辦法在胚胎干細胞中徹底敲除這個基因。勤快的Yoshimi于是用較高濃度的G418從干細胞中篩到了純合的敲除株，還是活得好好的，沒有表型[12]。Shinya后來在回憶的時候打趣到：小鼠很happy，細胞也很happy，唯一不happy的就是可憐的學生Yoshimi了。

但是花這么多精力做的敲除小鼠不能就這么算了吧。Shinya又一次開動腦筋，想要廢物利用。他發(fā)現由于Fbx15只在胚胎干細胞表達，Fbx15 promoter操控的抗藥基因neo在成體的成纖維細胞里不表達，所以細胞對藥物 G418敏感；而敲除鼠里得到的胚胎干細胞卻可以在很高濃度的 G418中生長。如果終末分化的成纖維細胞能誘導成胚胎干細胞，那么它就會產生對 G418的 抗藥性。即便成纖維細胞只是獲得了部分胚胎干細胞的特性，那么它也應該能抗低濃度的 G418 （圖二）。Fbx15敲除鼠實際上提供了很好的篩選誘導干細胞的系統(tǒng)！

京都大學的化蛹成蝶階段-iPS

憑借他鑒定胚胎干細胞維持因子的出色工作，2004年Shinya在名氣更大的京都大學找到新的職位。除了Fbx15敲除鼠的篩選系統(tǒng)，Shinya還積累了他鑒定的加上文獻報道的24個維持因子。Shinya躍躍欲試，他準備破殼而出，拍翅成蝶了！

Shinya的另一位學生Kazutoshi Takahashi此前已經發(fā)表了一篇關于干細胞致癌性的Nature文章。Shinya決意讓他來承擔最大膽的課題-逆分化成體細胞，因為他知道，有一篇Nature文章保底，即便接下來的幾年一無所獲，他的學生也能承受得了。

圖二：篩選iPS的系統(tǒng)。在Fbx15敲除鼠基因組，Fbx15 基因被bgeo基因（β-galactosidase 和 neo的融合基因）取代。成鼠角形的成纖維細胞中，內源的Fbx15 promoter關閉，bgeo不能表達，細胞在G418藥物處理下會死亡；在圓形的多能干細胞中，Fbx15 promoter會啟動bgeo，細胞能在G418中生長。如果成纖維細胞感染攜帶干細胞維持因子的逆轉錄病毒，并能夠被逆分化成干細胞，那么它就能逃過G418的選擇壓力，增殖形成細胞克隆[13]。

即便有很好的篩選系統(tǒng)，這個課題在當初看來也是非常冒險甚至是不可行的。當時的人們普遍認為成體細胞失去了多能性，也許成體細胞本身就是不可逆轉的，你做什么也沒有用。即便通過轉核技術實現了成體細胞核命運的逆轉，那也只是細胞核，不是整個細胞。胚胎細胞和成體細胞的染色體是一樣的，細胞核具有全能性，尚可理解。而且要實現細胞核的逆轉還需要轉到卵細胞，讓卵細胞質幫助它重編程，而卵細胞質中的蛋白不計其數。如果要實現整個細胞命運的逆轉需要讓細胞質中所有的蛋白重新洗牌。即便細胞可以重新編程，那也應該是很多蛋白共同參與的。Shinya當年在手上的僅僅是24個因子。也許有另外幾百幾千種因子被遺漏，缺少其中一種都無法實現重編程。用這24個因子異想天開要實現細胞重編程，根據已有的知識從邏輯上講可能性幾乎為零。

Kazutoshi這個愣頭青不管這些，他給成纖維細胞一一感染過表達這些因子的病毒，結果當然沒有篩選到任何抗 G418的細胞。Shinya知道如何保持學生的斗志，他故作鎮(zhèn)定地說：你看，這說明我們的篩選系統(tǒng)很好啊，沒有出現任何假陽性。

在試了一遍無果后，Kazutoshi大膽提出想把24個病毒混合起來同時感染細胞。Shinya覺得這是很愚蠢的想法：沒人這么干過啊同學，不過死馬當作活馬醫(yī)，你不嫌累的話就去試吧。

等了幾天，奇跡竟然發(fā)生了。培養(yǎng)板上稀稀疏疏地竟然出現了十幾個抗 G418的細胞克?。∫粋€劃時代的發(fā)現誕生了。

關鍵實驗取得突破以后，其后的事情就按部就班了。Kazutoshi每次去掉一個病毒，把剩下的23個病毒混合感染成體細胞，看能長多少克隆，以此來鑒別出哪一些因子是誘導干細胞所必需的。最后他鑒定出了四個明星因子：Oct3/4, Sox2, c-Myc,和 Klf4。這四個因子在成纖維細胞中過表達，就足以把它逆轉為多能干細胞！

那抗 G418的細胞克隆就一定是多能干細胞嗎？他們通過一系列的指標，比如基因表達譜，分化潛能等，發(fā)現這些細胞在相當大的程度上與胚胎干細胞相似。

2006年Shinya報道了小鼠誘導干細胞，引起科學界轟動[13]；2007年，他在人的細胞中同樣實現了細胞命運的逆轉，科學界沸騰了[14]。

展望

回過頭來，種種不可能，Shinya怎么就幸運地成功了呢？現在通過更多的研究，我們知道，干細胞特性的維持是由一個基因網絡來共同作用的，通過上調某些關鍵基因就可以重建這個網絡，逆轉細胞的命運；山中伸彌最后鑒定的四個因子也不是必須的，用24個因子以外的其它因子進行組合可以達到同樣的目的。這好比是一張大網，你只要能撐起其中的幾個支點，就可以把整張網撐起來。

iPS的發(fā)現有著不同尋常的意義。首先，它更新了人們的觀念，從此之后人們不再認為細胞的命運不可逆轉，不單可以逆轉，細胞其實還可以實現不同組織間的轉分化（Transdifferentiation）。其次，iPS細胞繞過了胚胎干細胞的倫理困境，很多實驗室都可以重復這個簡單的實驗得到iPS，開展多能干細胞的研究。其三，iPS細胞具有很多胚胎干細胞所沒有的優(yōu)勢：來自于病人自身的iPS細胞體外操作后重新植入病人體內，免疫反應將大大減少；如果將病人的體細胞逆轉為ips細胞，在體外分化觀察在這個過程中出現的問題，就可以實現在培養(yǎng)皿里某種程度上模擬疾病的發(fā)生；疾病特異的iPS在體外擴增和分化以后，還可以用于篩選治療該疾病的藥物，或者對藥物的毒性進行檢測（圖三）。

圖三：iPS細胞的潛在用途。采自病人的少量成體細胞被逆分化成iPS細胞后，能夠在體外增殖，改造，分化成組織特異性的功能細胞。這些功能細胞重新植入人體可以幫助/取代受損的或者得病的器官/組織。iPS或者這些功能細胞也可以作為疾病模型用于一些藥物的篩選和毒性測試（圖片來自諾貝爾獎網站）。

但是這僅僅是新的開始，生命科學如此復雜和不可預測，要把這些愿景變成現實，讓iPS真正造福人類，這其中還有重重的困難。Shinya Yamanka，這位科學的寵兒，懷著最初幫助更多病人的理想，無畏地踏上了新的征程。