摘要：實(shí)驗(yàn)室自建方法(laboratory developed tests, LDTs)是指由實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部研發(fā)、確認(rèn)和使用、以診斷為目的的體外診斷方法。僅限于本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用，不得在市場(chǎng)銷售，也不得轉(zhuǎn)移到其他實(shí)驗(yàn)室使用。做好實(shí)驗(yàn)室自建分子檢測(cè)項(xiàng) ......
實(shí)驗(yàn)室自建方法(laboratory developed tests, LDTs)是指由實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部研發(fā)、確認(rèn)和使用、以診斷為目的的體外診斷方法。僅限于本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用，不得在市場(chǎng)銷售，也不得轉(zhuǎn)移到其他實(shí)驗(yàn)室使用。做好實(shí)驗(yàn)室自建分子檢測(cè)項(xiàng)目(laboratory－developed molecular tests, LDMTs)，使其既能滿足臨床日益增長(zhǎng)的分子診斷需求，又符合我國(guó)行政管理規(guī)范的要求。
LDMTs的監(jiān)管要求
1. 實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)以及環(huán)境要求
（1）實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)：
分子診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過衛(wèi)生計(jì)生行政部門認(rèn)可的臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室審核驗(yàn)收，并在有效期內(nèi)。
（2）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求：
要求達(dá)到國(guó)家相關(guān)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室要求。
2. 人員要求
（1）開展LDMTs，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該有相應(yīng)團(tuán)隊(duì)(應(yīng)至少包括具有檢驗(yàn)等相關(guān)專業(yè)的博士學(xué)位并具有相關(guān)研究經(jīng)驗(yàn)和工作基礎(chǔ)的研究人員1名，臨床相關(guān)專業(yè)中級(jí)以上醫(yī)師1名，檢驗(yàn)相關(guān)專業(yè)中級(jí)以上檢驗(yàn)技師1名)。
（2）自建分子診斷項(xiàng)目負(fù)責(zé)人應(yīng)至少具有副高級(jí)以上專業(yè)技術(shù)職稱、博士學(xué)位、并從事分子診斷工作至少3年。
（3）分子診斷實(shí)驗(yàn)室操作人員應(yīng)經(jīng)過有資質(zhì)的培訓(xùn)機(jī)構(gòu)培訓(xùn)合格取得上崗證。
（4）簽發(fā)分子病理報(bào)告的醫(yī)師應(yīng)至少具有中級(jí)病理學(xué)專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格，并有從事分子病理工作的經(jīng)歷。
3. 管理要求
（1）開展LDMTs項(xiàng)目之前，應(yīng)有相關(guān)臨床科室的申請(qǐng)、醫(yī)務(wù)機(jī)構(gòu)的審批以及醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意。
（2）應(yīng)通過相關(guān)行政管理機(jī)構(gòu)組織的同行專家委員會(huì)的評(píng)議，或經(jīng)所在地省、自治區(qū)、直轄市人民政府相關(guān)行政部門審核同意。
（3）通過初次評(píng)議的項(xiàng)目在試運(yùn)行一年后，宜申請(qǐng)相關(guān)行政管理機(jī)構(gòu)組織的同行專家委員會(huì)的再評(píng)議，通過再次評(píng)議的項(xiàng)目，正式運(yùn)行。
（4）通過再次評(píng)議的項(xiàng)目，宜接受每3年一次的復(fù)評(píng)審，用以監(jiān)督該項(xiàng)目的運(yùn)行情況。
（5）停用項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)和措施：一旦造成醫(yī)療糾紛或進(jìn)入司法程序，相關(guān)單位的LDMTs項(xiàng)目應(yīng)立即停止使用，并進(jìn)入緊急審核程序，通過相關(guān)行政管理機(jī)構(gòu)組織的同行專家委員會(huì)的評(píng)議后，項(xiàng)目方可恢復(fù)檢驗(yàn)。
（6）實(shí)驗(yàn)室須建立相應(yīng)的程序和管理制度。
質(zhì)量控制的基本要求
(一)應(yīng)不低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方法規(guī)要求，如《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理方法》、《CNAS－CL36醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》等。
(二)開展LDMTs項(xiàng)目臨床應(yīng)用檢測(cè)之前，應(yīng)進(jìn)行性能確認(rèn)。
(三)實(shí)驗(yàn)室自建分子診斷項(xiàng)目中，涉及的市售試劑耗材的質(zhì)量保證，應(yīng)不低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方法規(guī)要求。
(四)定性檢測(cè)項(xiàng)目，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰性、弱陽性和/或陽性質(zhì)控物。如為基因突變、基因多態(tài)性或基因型檢測(cè)，則應(yīng)包括最能反映檢測(cè)情況的突變或基因型樣品，每批檢測(cè)的質(zhì)控至少應(yīng)有一種基因突變或基因型，并建議在一定周期內(nèi)涵蓋所有的基因型。
(五)定量檢測(cè)項(xiàng)目，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置高值、中值和低值質(zhì)控物。
(六)應(yīng)參加通過認(rèn)可的能力驗(yàn)證計(jì)劃提供者提供的能力驗(yàn)證計(jì)劃。
(七)在沒有能力驗(yàn)證提供的情況下，通過與其他實(shí)驗(yàn)室(如已獲認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室、使用相同檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)室、使用配套系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室)比對(duì)的方式確定檢驗(yàn)結(jié)果的可接受性時(shí)，應(yīng)滿足如下要求
：
1. 規(guī)定比對(duì)實(shí)驗(yàn)室的選擇原則。
2. 樣品數(shù)量：至少5份，包括正常和異常水平或不同常見基因突變或基因型；頻率：至少每年2次。
3. 判定標(biāo)準(zhǔn)：至少應(yīng)有≥80%的結(jié)果符合要求。
4. 實(shí)驗(yàn)室使用兩套及以上檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)同一項(xiàng)目時(shí)，應(yīng)有比對(duì)數(shù)據(jù)表明其檢測(cè)結(jié)果的一致性，比對(duì)頻次每年至少1次，樣品數(shù)量不少于20份，濃度水平應(yīng)覆蓋測(cè)量區(qū)間，計(jì)算回歸方程，系統(tǒng)誤差應(yīng)<>。應(yīng)定期(至少每年1次，每次至少5份臨床樣品)進(jìn)行檢驗(yàn)人員的結(jié)果比對(duì)、考核并記錄。使用不同生物參考區(qū)間的檢測(cè)系統(tǒng)間不宜進(jìn)行比對(duì)。
LDMTs性能確認(rèn)的基本要求（略）
LDMTs的方法學(xué)確認(rèn)的技術(shù)指標(biāo)
1. 準(zhǔn)確性(accuracy)：
對(duì)定量分析，準(zhǔn)確性指的是'接近真實(shí)值'，而對(duì)于定性分析，準(zhǔn)確性則是指與比對(duì)試驗(yàn)或者標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。
確認(rèn)方法：準(zhǔn)確性的評(píng)估可以使用參考物質(zhì)進(jìn)行評(píng)定，或者與另一種臨床上有連續(xù)性并被普遍接受的方法(所謂'金標(biāo)準(zhǔn)')進(jìn)行比對(duì)。在缺乏金標(biāo)準(zhǔn)的情況下，可以引用參考文獻(xiàn)作為指導(dǎo)。用于確認(rèn)的標(biāo)本通常選用與臨床檢測(cè)同類的標(biāo)本。樣品數(shù)n≥20，濃度應(yīng)覆蓋測(cè)量區(qū)間。定性結(jié)果一致性宜大于90%，定量結(jié)果一般可接受為不能超過對(duì)照方法平均含量的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差或者15%變異度。
2. 精確性(precision)：
精確性是指規(guī)定條件下所獲得獨(dú)立測(cè)量結(jié)果的接近程度，評(píng)價(jià)檢測(cè)技術(shù)的重復(fù)性。包括同一批標(biāo)本用同一種方法同一種儀器的精密度(repeatability)，以及不同日間、操作者、不同儀器、不同實(shí)驗(yàn)之間的精密度(reproducibility)。
確認(rèn)方法：因需考慮安排不同的操作者、不同批號(hào)的試劑以及不同型號(hào)的儀器來進(jìn)行多次的重復(fù)操作，一般建議確認(rèn)一項(xiàng)分子檢驗(yàn)方法的精密度大致需要20個(gè)工作日。在選擇待測(cè)標(biāo)本用于確認(rèn)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一般用高和低2個(gè)不同含量標(biāo)本來進(jìn)行，并接近檢測(cè)限。標(biāo)本類型、取樣與儲(chǔ)存條件應(yīng)盡量符合待測(cè)的臨床標(biāo)本。目前尚缺乏統(tǒng)一的國(guó)際參考標(biāo)準(zhǔn)來確定臨床診斷實(shí)驗(yàn)室可普遍接受的精密度范圍。對(duì)于定性試驗(yàn)，判斷結(jié)果的一致性，一般符合率應(yīng)該大于90%。對(duì)于定量試驗(yàn)，一般確認(rèn)實(shí)驗(yàn)可接受的精密度為不能超過已知靶分子平均含量的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差或者15%變異度。FDA建議變異度不能超過20%。CNAS的要求則以能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評(píng)評(píng)價(jià)界限(靶值±0.4對(duì)數(shù)值)作為允許總誤差(TEa)，重復(fù)性精密度<3>；中間精密度<4>。
3. 參考范圍(reference range)：
指特定人群檢測(cè)結(jié)果的預(yù)計(jì)數(shù)值范圍，等同于參考區(qū)間或者正常參考值范圍，其數(shù)據(jù)來源于不存在可能影響檢測(cè)結(jié)果疾病的人群的樣本。
確認(rèn)方法：對(duì)于大部分檢測(cè)項(xiàng)目，正常參考范圍與異常值范圍都是在前期研究中就已經(jīng)明確，目的是為了給特定患者群體確定正常數(shù)值范圍。對(duì)于定性試驗(yàn)，參考范圍可以是陰性、正常、無克隆性增生，或者其他能夠表明檢測(cè)結(jié)果是否正常的用詞。需要注意的是，某些檢測(cè)項(xiàng)目是沒有參考范圍的。如對(duì)于HCV陽性樣本的HCV基因分型檢測(cè)，就無法在所有HCV已知基因型中選出一個(gè)'正常'的基因型。
4. 可報(bào)告范圍(reportable range)：
可報(bào)告范圍是指當(dāng)儀器、試劑或系統(tǒng)的測(cè)量反應(yīng)為有效時(shí)的檢測(cè)結(jié)果范圍。簡(jiǎn)單地說，報(bào)告范圍包括所有可能被報(bào)告的結(jié)果。
確認(rèn)方法：對(duì)于定性測(cè)試，應(yīng)包括所有的報(bào)告結(jié)果(如野生型純合子、突變型雜合子或純合子)。對(duì)于定量試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室必須明確定量分析中的分析測(cè)量范圍(analytic measurement range, AMR)是指待測(cè)樣品在未被稀釋、濃縮或其他不屬于常規(guī)檢查步驟部分的預(yù)處理?xiàng)l件下，一種方法可直接測(cè)量待測(cè)樣品值的范圍。因?yàn)榭梢韵♂寴悠?，?bào)告范圍可能大于AMR。
5. 分析靈敏度(analytic sensitivity)：
檢測(cè)系統(tǒng)或方法可檢測(cè)的最低分析物濃度稱為分析靈敏度或檢測(cè)限。在分子檢測(cè)領(lǐng)域，分析敏感性是指用該項(xiàng)分子測(cè)試技術(shù)能夠測(cè)到生物標(biāo)本中待測(cè)靶核酸分子的最低含量。定性實(shí)驗(yàn)中，分析靈敏性常用'最低檢測(cè)限(limit of detection, LoD)'來表達(dá)。這種檢測(cè)低限指能連續(xù)在同一個(gè)標(biāo)本中測(cè)到靶核酸的可能性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上概率≥95%。定量實(shí)驗(yàn)中，多用'定量限(limit of quantitation, LoQ)'來表示。與LoD不同，LoQ表示一個(gè)能夠檢測(cè)出的靶物質(zhì)在標(biāo)本中的最高和最低的量。對(duì)于某些分子檢測(cè)方法來說，LoD與LoQ相同。但由于LoD不需要考慮是否在線性范圍內(nèi)，所以LoD常常比LoQ還要低。
確認(rèn)方法：通常通過一系列稀釋已知含量的靶病原體或分子來分析最低檢測(cè)限。在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下并用同一個(gè)批號(hào)的制劑，重復(fù)測(cè)定已稀釋至最低濃度的標(biāo)本，重復(fù)測(cè)定來自臨床的5個(gè)標(biāo)本，60個(gè)結(jié)果，CV值小于指定標(biāo)準(zhǔn)視為接受。
6. 分析特異性(analytic specificity)：
是指該方法本身能夠檢測(cè)出特定待測(cè)核酸分子的能力。與其他相關(guān)的核酸分子的交叉反應(yīng)和標(biāo)本條件的變化是否對(duì)待測(cè)分子的檢測(cè)造成影響。分子測(cè)定方法的交叉反應(yīng)多來源于其他有相關(guān)或類似的核酸分子。干擾物質(zhì)是指標(biāo)本中其他非靶分子物質(zhì)對(duì)待測(cè)的靶分子檢測(cè)正確性的影響。在生物樣本中，內(nèi)源性干擾物質(zhì)除去包括常見的血液中的血紅素、膽紅素、三酯甘油外，還有很多肉眼不能觀察到的與疾病有關(guān)的代謝產(chǎn)物等。外源性干擾物常見于采集和處理標(biāo)本過程中的污染。例如：采樣管含有的抗凝劑、防腐劑、穩(wěn)定劑，手套上的滑石粉以及核酸分子提取純化過程中殘留的試劑。
確認(rèn)方法：評(píng)價(jià)分子檢測(cè)方法的交叉反應(yīng)性，首先要獲得盡可能多的可能與特定待測(cè)靶分子發(fā)生交叉反應(yīng)的分子核酸序列并加以分析。如果在所測(cè)的標(biāo)本中存在某些結(jié)構(gòu)和核酸序列相近的病原體或內(nèi)源性生物分子，應(yīng)對(duì)這些病原體和生物分子進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)價(jià)。干擾物的作用是抑制正常PCR反應(yīng)，使結(jié)果偏低，從而造成假陰性。最常見的驗(yàn)證方法之一是在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的過程中加入一個(gè)已知的PCR反應(yīng)對(duì)照。在測(cè)定過程中，如果PCR反應(yīng)對(duì)照未發(fā)生擴(kuò)增或擴(kuò)增產(chǎn)物量低于預(yù)期值范圍，即可證實(shí)有干擾抑制物在該標(biāo)本中存在。
7. 臨床驗(yàn)證(clinical validity)：
臨床驗(yàn)證是確定某種分子檢測(cè)技術(shù)檢出核酸分子診斷疾病的能力。臨床驗(yàn)證的目的是評(píng)價(jià)這種新的分子檢測(cè)技術(shù)是否適合于特定的臨床疾病的診斷。臨床敏感性不同于分析敏感性：分析敏感性主要指參考方法檢測(cè)結(jié)果為陽性的結(jié)果中，用實(shí)驗(yàn)方法得到陽性結(jié)果的一致性；臨床敏感性主要指結(jié)果為真陽性的人群中真正罹患某種疾病或異常的比例，強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床診斷的一致性。同樣的，臨床特異性也不同于分析特異性，分析特異性主要指參考方法檢測(cè)結(jié)果為陰性的結(jié)果中，用實(shí)驗(yàn)方法得到陰性結(jié)果的一致性。臨床特異性主要指實(shí)驗(yàn)結(jié)果為真陰性的人群中真正沒有罹患某種疾病或異常的比例[12]。也強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床診斷的一致性。值得注意的是在評(píng)價(jià)某些罕見的疾病，由于陽性病例的數(shù)量有限，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行臨床敏感性評(píng)價(jià)存有一定難度，這時(shí)可以引用文獻(xiàn)報(bào)道的臨床敏感性和特異性作為理論支撐。正常對(duì)照容易收集，比較容易實(shí)現(xiàn)臨床特異性的評(píng)價(jià)。
分子診斷項(xiàng)目分析前、中、后質(zhì)量按相關(guān)要求執(zhí)行，國(guó)家有相關(guān)規(guī)定的按相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。
編寫組成員(按姓氏漢語拼音順序排序)：李敏(上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院)，劉維薇(上海同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院)，王華梁、肖艷群(上海市臨床檢驗(yàn)中心)
中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)師分會(huì)分子診斷專家委員會(huì)成員：顧問：張曼(中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)師分會(huì)會(huì)長(zhǎng))，主任委員：王華梁，副主任委員：崔巍、關(guān)明、潘世楊
委員(按姓氏漢語拼音順序排序)：潘世楊(江蘇省人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部)、傅啟華(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科)、鄧芳(安徽省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科)、陶志華(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科)、李伯安(中國(guó)人民解放軍第三○二醫(yī)院檢驗(yàn)科)、李敏(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科)、劉維薇(上海市第十人民醫(yī)院檢驗(yàn)科)、婁加陶(上海市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科)、關(guān)明(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科)、邱廣斌(中國(guó)人民解放軍第二○二醫(yī)院檢驗(yàn)科)、肖艷群(上海市臨床檢驗(yàn)中心分子生物學(xué)室)、張曼(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院檢驗(yàn)科)、鄭磊(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科)、陳鳴(第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院檢驗(yàn)科)、陳晉(上海市肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科)、陳國(guó)千(江蘇省無錫市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科)、尚世強(qiáng)(浙江大學(xué)附屬兒童醫(yī)院)、鄒琳(重慶醫(yī)科大附屬兒童醫(yī)院臨床分子醫(yī)學(xué)中心)、崔巍(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科)、應(yīng)斌武(四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科)、袁宏(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)、王華梁(上海市臨床檢驗(yàn)中心)、王偉靈(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科)。
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