人類心臟形成類器官概括了早期心臟和前腸的發(fā)育
心臟是在胚胎中形成的第一個功能器官。它起源于內(nèi)臟的中胚層，內(nèi)臟的中胚層是在胃造瘺過程中從原始條紋中出現(xiàn)的。心臟前中胚層規(guī)范后，后代在胚胎中線的每一側(cè)形成雙側(cè)心臟形成區(qū)域，與發(fā)育中的前腸內(nèi)胚層13緊密接近并感應(yīng)交換。心臟形成區(qū)域的細胞跨過中線延伸并融合到心管中，該心管由兩層組成，即心肌層和心內(nèi)膜。后來，心管經(jīng)歷循環(huán)，這將定位未來的心腔。心臟的最外層，即心外膜，源自稱為“前皮膜”的祖細胞群，并產(chǎn)生心臟成纖維細胞和平滑肌細胞。人類多能干細胞（hPSC），包括胚胎干細胞（hESCs）和誘導型PSC（hiPSCs），具有自組織成三維（3D）結(jié)構(gòu)的能力，這種結(jié)構(gòu)稱為類器官，類似于體外的類胚胎組織模式。雖然類器官模型已被用于廣泛的范圍的組織中描述的，但是在心血管領(lǐng)域進展有限。
基于此，來自萊布尼茨生物技術(shù)和人工器官研究實驗室（LEBAO）的Robert Zweigerdt教授，帶領(lǐng)團隊通過將人類多能干細胞聚集體嵌入Matrigel中，然后通過小分子的雙相WNT途徑調(diào)控的定向心臟分化，來生成復雜的，高度結(jié)構(gòu)化的三維心臟形成類器官（HFO）。相關(guān)研究成果以“Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development”為題，在線發(fā)表在《Nature Biotechnology》雜志上。
研究人員通過分化嵌入基質(zhì)膠的hPSC聚集體形成穩(wěn)定的HFO。自由浮動HPSC聚集體有效地分化成在懸浮培養(yǎng)中高純度的心肌細胞在響應(yīng)于經(jīng)典Wnt途徑調(diào)制由小分子如CHIR99021（CHIR; WNT通路活化劑）和IWP2（WNT通路抑制劑）。對于HFO的形成，研究人員應(yīng)用了等效的協(xié)議，但是使用了嵌入到Matrigel中的單個hPSC聚集體，其大小已定義（基于分化日減去4（d-4）時聚集體形成所播種的細胞數(shù)量）。在測試的四個不同起始細胞數(shù)（500、3,500、5,000和10,000個細胞）中，HFO的形成僅以5,000個細胞成功。
研究人員還發(fā)現(xiàn)NKX2.5–eGFP的表達表明了ML（和部分OL）的致心肌性質(zhì)，通過對心肌標志物肌球蛋白重鏈（MHC）和心肌肌鈣蛋白T的免疫熒光（IF）染色證實（cTnT），其中連續(xù)的正面部分加強了ML背面覆蓋IC的觀察。第二個心臟場（SHF）標記ISL1從d7到d13的HFO的流式細胞術(shù)染色顯示d7上?77％的NKX2.5–eGFP / ISL1雙陽性SHF樣細胞，在d13上降至?25％。相比之下，我們沒有檢測到代表第一個心臟區(qū)域（FHF）的任何TBX5陽性細胞，這表明在氫氟烯烴心肌細胞表現(xiàn)出SHF樣表型（預期為WNT-定向分化）。根據(jù)它們的動作電位特征，進行了膜片鉗以進一步確定HFO衍生的NKX2.5–eGFP陽性心肌細胞的心臟表型。該分析表明，除一些非典型動作電位外，次要細胞群（5.7％）顯示出心房樣表型，而大多數(shù)（75.5％）被分配為心室樣表型（擴展數(shù)據(jù)圖2c-f）。對于后者，其他動作電位特性如低上沖程速度建議未成熟心室樣表型，在一致性施加化學WNT調(diào)制之前工作。通常在d7–d10觀察到HFO收縮的開始。HFO通過鈣成像顯示出明顯的收縮模式：通常會發(fā)現(xiàn)圓形的跳動模式，但是在單個HFO中，觀察到了從不同的起始點開始的波前狀傳播。
為了更詳細地探討HFO中組織的身份，研究人員將單細胞RNA測序（scRNA-seq）應(yīng)用于兩個HFO。兩個樣本的t分布隨機鄰居嵌入（t-SNE）圖的覆蓋圖顯示了相同位置的細胞群，從而證實了各個HFO中組織形成的穩(wěn)健性）。自動聚類揭示了七個聚類，其中一個顯示了代表死細胞的線粒體基因的顯著過表達。其他六個簇顯示群體特異性表達模式，證實了微陣列分析和IF染色結(jié)果。由這些簇表達的關(guān)鍵基因的t-SNE圖在圖4c和擴展數(shù)據(jù)圖4c中給出。最大的簇（約占所有活細胞的38％）的特征在于眾多心臟基因，包括TNNT2（cTnT），MYH6（MHCα）和NKX2.5。ISL1在該簇中的表達較低，這與擴展數(shù)據(jù)圖2b中所示的d13 HFO的流式細胞儀數(shù)據(jù)一致。在該簇中還發(fā)現(xiàn)了TBX5和HCN4的表達。這些標記都與FHF了初步聯(lián)系。
綜上所述，該研究團隊在此描述了一種誘導自組織hPSC衍生HFO的可靠方法，該方法由內(nèi)襯心內(nèi)膜樣細胞，被ST樣細胞包圍，由不同的AFE和PFE組織構(gòu)成，并被血管網(wǎng)絡(luò)覆蓋的ML組成。HFOs在發(fā)育中的胚胎中顯示出與早期心臟和前腸膠原蛋白的形態(tài)相似性，其中在心臟前中胚層規(guī)格確定后，心臟祖細胞形成了靠近發(fā)育中的AFE 13的心臟形成區(qū)域。來自AFE的信號介導來自中胚層的心內(nèi)膜前體細胞的分層，從而使心內(nèi)膜細胞位于發(fā)育中的心肌和AFE之間。同樣，在HFO中，心內(nèi)膜樣細胞在ML和IC（包含AFE組織）之間形成襯里，盡管需要進一步評估以明確證明這些細胞代表心內(nèi)膜。
參考文獻
1、Drakhlis L, Biswanath S, Farr CM, et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol. 2021 Feb 8. doi: 10.1038/s41587-021-00815-9. Epub ahead of print. PMID: 33558697.
2、Múnera JO, Wells JM. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods Mol Biol. 2017;1597:167-177. doi: 10.1007/978-1-4939-6949-4_12. PMID: 28361317.
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