Nature 子刊：高彩霞團隊開發(fā)可預測的精細下調(diào)目標基因蛋白表達的新方法
來源：生物世界 2023-03-10 17:30
基因編輯技術在植物中的開發(fā)和應用為分子設計育種帶來了革命性的變化?；诨蚓庉嫾夹g建立基因精細調(diào)控的方法對于精準設計育種至關重要。目前應用最為廣泛的基因表達調(diào)控方法，如 CRISPR-Cas、CRIS
基因編輯技術在植物中的開發(fā)和應用為分子設計育種帶來了革命性的變化?；诨蚓庉嫾夹g建立基因精細調(diào)控的方法對于精準設計育種至關重要。目前應用最為廣泛的基因表達調(diào)控方法，如 CRISPR-Cas、CRISPRi 和 RNAi 等技術只能夠?qū)崿F(xiàn)對基因的完全敲除或?qū)⒒虻谋磉_抑制到不可預測的水平。
利用 CRISPR-Cas9 技術對啟動子區(qū)域進行編輯，可以在轉(zhuǎn)錄層面將基因的表達調(diào)控至不同的水平，并產(chǎn)生大量不可預測的數(shù)量性狀變異。但這種方法將耗費大量精力用以篩選理想的突變體。因此，開發(fā)新的能夠可預測地精細調(diào)控基因表達的方法可以極大拓展現(xiàn)有的基因表達調(diào)控工具箱，為作物遺傳改良提供有力的技術支撐。
上游開放閱讀框（uORF）是真核生物 mRNA 上普遍存在的翻譯調(diào)控元件，對基因主效開放閱讀框 (primary open reading frame, pORF) 的翻譯具有抑制作用。
2018 年，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所高彩霞研究組率先利用 CRISPR-Cas9 技術對 uORF 進行編輯，建立了精細上調(diào)內(nèi)源基因翻譯的方法，并利用該方法培育出了維生素 C 含量顯著提高的生菜種質(zhì)。2020 年，高彩霞研究組又將這一技術應用于草莓的遺傳改良，獲得了梯度糖分的系列草莓新種質(zhì)。
2023 年 3 月 9 日，高彩霞團隊在 Nature Biotechnolgoy 期刊發(fā)表了題為：Tuning plant phenotypes by precise, graded downregulation of gene expression 的研究論文。此前研究基礎上，通過對上游開放閱讀框（uORF）進行設計，開發(fā)了能夠可預測地精細下調(diào)目標基因蛋白表達的新方法，為未來的分子設計育種提供了重要的技術手段。
上游開放閱讀框（uORF）的長度及 uORF 與 pORF 之間的距離等多種因素都會影響 uORF 對 pORF 翻譯的抑制能力。因此，研究團隊猜想可通過以下兩種策略抑制目標基因的翻譯：第一種是在目標基因的 5' 非翻譯區(qū)（5'UTR）從頭產(chǎn)生新的 uORF；第二種是原位突變內(nèi)源 uORF 的終止密碼子以延伸其表達框長度。原生質(zhì)體瞬時系統(tǒng)的結(jié)果表明這兩種策略可以有效地將 pORF 的翻譯抑制到不同的水平，且對其 mRNA 的表達量幾乎沒有影響。此后，研究團隊利用堿基編輯和引導編輯系統(tǒng)獲得了含有新創(chuàng)制 uORF 或內(nèi)源 uORF 被延伸的水稻突變體植株，通過對突變體植株的蛋白表達水平和表型進行檢測，發(fā)現(xiàn)突變體中引入的 uORF 變體對目標蛋白表達和表型的影響與瞬時系統(tǒng)結(jié)果一致。
為了實現(xiàn)對目標基因的表達進行連續(xù)的梯度下調(diào)，該研究結(jié)合以上兩種策略，分別在水稻的 OsTCP19、OsTB1 和 OsDLT 基因的 5'UTR 區(qū)域設計了一系列具有不同抑制能力的 uORFs，瞬時系統(tǒng)的結(jié)果表明 pORF 的翻譯水平被梯度地抑制到了原始水平的 2.5%-84.9%，實現(xiàn)了對基因的梯度敲降。OsDLT 基因編碼 GRAS 蛋白家族成員，參與了水稻油菜素內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導途徑，調(diào)控水稻株高、分蘗數(shù)、種子大小等多個重要農(nóng)藝性狀。該研究中以 OsDLT 基因為靶標，通過編輯 OsDLT 基因的 5'UTR，獲得了一組具有不同葉夾角、株高和分蘗數(shù)的突變體，且突變體的表型變化趨勢與瞬時系統(tǒng)預測結(jié)果一致。
通過編輯 uORF 培育具有目標性狀的水稻植株。(a, b) 從頭創(chuàng)制新的 uORFs (a) 或延伸內(nèi)源 uORFs (b) 抑制目標基因的蛋白表達。(c) 通過產(chǎn)生一系列具有不同抑制能力的 uORFs 梯度下調(diào)基因的表達。(d, e) 含有 uORFs 變體的突變體對油菜素內(nèi)酯的敏感性 (d) 和植株表型 (e)。
綜上所述，該研究通過對 uORF 進行設計，開發(fā)了一種普適的能夠可預測地精細下調(diào)基因表達的新方法，為未來的分子設計育種提供了重要的技術手段。
高彩霞研究組博士后薛郴銷為該論文的第一作者，高彩霞研究員為通訊作者。該研究得到國家重點研發(fā)計劃項目、中國科學院戰(zhàn)略重點項目、中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部等的經(jīng)費資助。
https://doi.org/10.1038/s41587-023-01707-w
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