肺癌是全球發(fā)病率和死亡率位居前列的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（
NSCLC）約占肺癌患者的80%以上，不僅存在高度侵襲性和異質(zhì)性，而且還具有復(fù)雜的組織學(xué)亞型和明顯的突變特征[1]。
單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）技術(shù)的進(jìn)步，使得高度異質(zhì)性的腫瘤微環(huán)境能夠被深入剖析。但是眾多scRNA-seq研究的主要局限是，每個研究的樣本量都是有限的，同時還缺乏基因組數(shù)據(jù)和長期隨訪數(shù)據(jù)。這些因素阻礙了對腫瘤微環(huán)境生物異質(zhì)性、治療耐藥性和生存結(jié)局的全面分析。
白細(xì)胞是NSCLC腫瘤微環(huán)境的重要組成細(xì)胞類型。過去針對大多數(shù)腫瘤的流式細(xì)胞術(shù)和組織學(xué)分析表明，中性粒細(xì)胞在瘤內(nèi)駐留白細(xì)胞中占比8%-20%[2,3]。
但是近年來，關(guān)于NSCLC的scRNA-seq數(shù)據(jù)卻極少提及中性粒細(xì)胞。所以，研究中性粒細(xì)胞在NSCLC 腫瘤微環(huán)境中的作用，具有極其重要的意義。
近期，來自奧地利因斯布魯克醫(yī)科大學(xué)的Zlatko Trajanoski和Andreas Pircher研究團隊合作在Cancer Cell上發(fā)表了重要的研究成果[4]。他們發(fā)現(xiàn)，NSCLC的腫瘤微環(huán)境中存在功能特性不同的組織駐留中性粒細(xì)胞（TRNs）亞群。更重要的是，TRNs的基因標(biāo)記與
免疫檢查點抑制劑治療的不良預(yù)后相關(guān)。
論文首頁截圖
研究團隊收集了來自19項研究和21個數(shù)據(jù)集的scRNA-seq公開數(shù)據(jù)，結(jié)合團隊自己的NSCLC數(shù)據(jù)集（UKIM-V），他們開發(fā)并整合出一個全面的、具有大規(guī)模樣本量的NSCLC單細(xì)胞核心圖譜。
核心圖譜包括212名NSCLC患者和86名對照者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以及196個腫瘤樣本和168個非腫瘤對照樣本。在212名NSCLC患者中，156人為肺腺癌（LUAD），41人為肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）。
在這個NSCLC核心圖譜中，他們發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞群僅占所有細(xì)胞的1.5%，但是圖譜里78%的中性粒細(xì)胞來自UKIM-V數(shù)據(jù)集，其中中性粒細(xì)胞分別占UKIM-V所有細(xì)胞的12%和所有白細(xì)胞的18%，與他們的流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)一致。
中性粒細(xì)胞在循環(huán)中的半衰期僅為7-10小時[5]，所以表達(dá)的mRNA分子量極低。通過整合六種不同的測序平臺，研究團隊發(fā)現(xiàn)，BD Rhapsody平臺捕獲的mRNA分子數(shù)量要豐富得多，因此可能更適合檢測低mRNA含量的細(xì)胞。
為了深入分析中性粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征，研究團隊利用BD Rhapsody平臺測序的UKIM-V隊列數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析。他們發(fā)現(xiàn)，LUSC中中性粒細(xì)胞比例明顯較高，而LUAD中巨噬細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞、2型肺泡細(xì)胞、過渡型棒狀細(xì)胞/2型肺泡細(xì)胞（transitional club/AT2）更為豐富。
研究的總體流程和細(xì)胞類型
接下來，他們根據(jù)患者腫瘤微環(huán)境浸潤模式對NSCLC患者進(jìn)行分層，發(fā)現(xiàn)了四種不同的
腫瘤免疫表型：免疫荒漠型（沒有明顯的免疫細(xì)胞浸潤，但腫瘤細(xì)胞比例高）；B細(xì)胞優(yōu)勢型（主要為B細(xì)胞，漿細(xì)胞，肥大細(xì)胞）；髓系細(xì)胞優(yōu)勢型（主要為巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞) ；T細(xì)胞優(yōu)勢型（主要為CD8 T細(xì)胞，CD4 T細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）。不同免疫表型也表現(xiàn)出具有差異性的細(xì)胞因子信號特征。
不同腫瘤免疫表型的細(xì)胞因子信號特征
早期研究發(fā)現(xiàn)LUAD和LUSC也呈現(xiàn)出不同的免疫景觀（landscapes），前者以炎癥狀態(tài)為主，后者以傷口愈合狀態(tài)為主[6]。
為了分析腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞之間配體-受體互作的在組織學(xué)中的差異，通過構(gòu)建細(xì)胞-細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)。
他們發(fā)現(xiàn)，LUAD以KDR（VEGFR2，
血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2）-VEGFA（血管內(nèi)皮生長因子A）通信上調(diào)為特征，通過促進(jìn)血管生成，開啟免疫抑制信號，而LUSC則以SPP1（分泌型磷蛋白1）和JAG-NOTCH信號通路上調(diào)為主要特征，前者促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，后者通過募集中性粒細(xì)胞調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境。
細(xì)胞互作分析
通過結(jié)合分析關(guān)聯(lián)的TCGA隊列數(shù)據(jù)的細(xì)胞類型轉(zhuǎn)錄組與生存數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)，腫瘤B細(xì)胞的富集度與NSCLC患者的良好預(yù)后成正相關(guān)，而中性粒細(xì)胞則呈負(fù)相關(guān)。對CD8 T細(xì)胞亞型的分析顯示，幼稚CD8 T細(xì)胞與良好預(yù)后呈正相關(guān)（下圖G）。
TCGA數(shù)據(jù)中細(xì)胞組成和生存率的關(guān)系
接下來，研究人員進(jìn)一步鑒定了NSCLC中TRNs的異質(zhì)性細(xì)胞亞群。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（TANs）和鄰近正常組織相關(guān)中性粒細(xì)胞（NANs）具有不同的表達(dá)譜特征，并且中性粒細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中VEGFA的主要來源，印證了TRNs重要的促血管生成作用。
他們還注意到，TANs中凝集素型氧化低密度脂蛋白受體1（LOX-1）表達(dá)升高，腫瘤組織中存在較多的LOX-1+細(xì)胞浸潤，但在匹配的相鄰的正常肺組織中未發(fā)現(xiàn)LOX-1+細(xì)胞浸潤，說明LOX-1可能是一種特異性的TANs標(biāo)記物。
為了深入解析TRNs不同亞群的異質(zhì)性，研究團隊繼續(xù)對圖譜中TRNs進(jìn)行聚類分析，鑒定出了4個TAN亞群和3個NAN亞群。
值得注意的是，TAN-2亞群CD274（PD-L1）/PDCD1（PD-1）信號通路顯著上調(diào)，提示了TAN對CD8 T細(xì)胞的免疫抑制作用，這與過去報道的中性粒細(xì)胞的富集與抗PD-1/PD-L1治療無應(yīng)答有關(guān)的結(jié)果一致[8]。
為了確定TRNs在NSCLC患者中的預(yù)后價值，研究團隊分析NSCLC患者治療前腫瘤的RNA-seq數(shù)據(jù)，這些患者經(jīng)歷了抗PD-L1抗體或化療藥單藥治療。結(jié)果顯示，TRN基因標(biāo)記與抗PD-L1治療應(yīng)答和生存預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)（p=0.003），但在化療組中并不顯著。
TRN基因標(biāo)記與免疫治療應(yīng)答和預(yù)后的關(guān)系
總的來說，這個研究在單細(xì)胞水平上對NSCLC腫瘤微環(huán)境進(jìn)行了全面剖析，不僅著重分析了數(shù)據(jù)稀缺的中性粒細(xì)胞群，對腫瘤微環(huán)境中具有不同功能特性的TRNs亞群進(jìn)行深入表征，而且還整合了基因組數(shù)據(jù)以及長期隨訪數(shù)據(jù)，揭示了中性粒細(xì)胞與免疫治療抵抗和不良生存結(jié)局的關(guān)聯(lián)，為后續(xù)開發(fā)中性粒細(xì)胞耗竭劑奠定了基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)：
[1] Chen Z, Fillmore CM, Hammerman PS, Kim CF, Wong KK. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases [published correction appears in Nat Rev Cancer. 2015 Apr;15(4):247]. Nat Rev Cancer. 2014;14(8):535-546. doi:10.1038/nrc3775
[2] Eruslanov EB, Bhojnagarwala PS, Quatromoni JG, et al. Tumor-associated neutrophils stimulate T cell responses in early-stage human lung cancer. J Clin Invest. 2014;124(12):5466-5480. doi:10.1172/JCI77053
[3] Kargl J, Busch SE, Yang GH, et al. Neutrophils dominate the immune cell composition in non-small cell lung cancer. Nat Commun. 2017;8:14381. Published 2017 Feb 1. doi:10.1038/ncomms14381
[4] Salcher S, Sturm G, Horvath L, et al. High-resolution single-cell atlas reveals diversity and plasticity of tissue-resident neutrophils in non-small cell lung cancer [published online ahead of print, 2022 Oct 27]. Cancer Cell. 2022;S1535-6108(22)00499-8. doi:10.1016/j.ccell.2022.10.008
[5] Shaul ME, Fridlender ZG. Tumour-associated neutrophils in patients with cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2019;16(10):601-620. doi:10.1038/s41571-019-0222-4
[6] Thorsson V, Gibbs DL, Brown SD, et al. The Immune Landscape of Cancer [published correction appears in Immunity. 2019 Aug 20;51(2):411-412]. Immunity. 2018;48(4):812-830.e14. doi:10.1016/j.immuni.2018.03.023
[7] Zilionis R, Engblom C, Pfirschke C, et al. Single-Cell Transcriptomics of Human and Mouse Lung Cancers Reveals Conserved Myeloid Populations across Individuals and Species. Immunity. 2019;50(5):1317-1334.e10. doi:10.1016/j.immuni.2019.03.009
[8] Kargl J, Zhu X, Zhang H, et al. Neutrophil content predicts lymphocyte depletion and anti-PD1 treatment failure in NSCLC. JCI Insight. 2019;4(24):e130850. Published 2019 Dec 19. doi:10.1172/jci.insight.130850
