近二十年，隨著免疫檢查點(diǎn)的不斷挖掘，腫瘤免疫的研究突飛猛進(jìn)，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞能表達(dá)PD-L1，與T細(xì)胞的PD-1結(jié)合，激活免疫抑制信號(hào)，從而逃逸腫瘤免疫。目前，靶向腫瘤細(xì)胞的PD-L1抑制劑，已經(jīng)是行之成效的腫瘤治療策略。
然而，當(dāng)前PD-L1的靶向治療存在個(gè)體反應(yīng)差異大和耐藥等缺點(diǎn)，導(dǎo)致現(xiàn)有的PD-L1抑制劑療效差強(qiáng)人意[1]。因此，深入研究PD-L1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，對(duì)于增強(qiáng)PD-L1阻斷療效、抑制腫瘤細(xì)胞免疫逃逸至關(guān)重要。
有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)與NF-κB的過(guò)度激活密切相關(guān)[2]。在經(jīng)典的信號(hào)通路中，NF-κB蛋白被IκBα蛋白結(jié)合而受到抑制，在IκBα經(jīng)磷酸化和泛素化被蛋白酶體降解后，NF-κB得以釋放并轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)PD-L1等靶基因表達(dá)。
腫瘤細(xì)胞在富含營(yíng)養(yǎng)的微環(huán)境中生長(zhǎng)，其增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為受到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)調(diào)控。但是腫瘤微環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別是葡萄糖，是否會(huì)影響腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，目前尚有待深入研究。
近日，浙江大學(xué)呂志民課題組發(fā)現(xiàn)，葡萄糖能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上調(diào)PD-L1表達(dá)。具體來(lái)說(shuō)，糖酵解的關(guān)鍵酶HK2磷酸化IκBα，促進(jìn)IκBα降解，從而激活NF-κB通路，進(jìn)而促進(jìn)PD-L1表達(dá)和腫瘤免疫逃逸。相關(guān)論文發(fā)表于頂級(jí)期刊Cell Metabolism上[3]。
論文首頁(yè)截圖
首先，研究人員使用葡萄糖處理膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是低氧還是常氧條件，PD-L1的表達(dá)都隨葡萄糖濃度的提高而增加，而轉(zhuǎn)錄抑制劑能抵消葡萄糖的促PD-L1表達(dá)作用，這表明葡萄糖經(jīng)糖酵解在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1進(jìn)行了調(diào)節(jié)。
HK2位于線粒體外膜，是葡萄糖進(jìn)行糖酵解的第一個(gè)限速酶，把葡萄糖磷酸化為6-磷酸葡萄糖（G6P）[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織糖酵解活躍，HK2過(guò)表達(dá)[5]。研究人員敲除了腫瘤細(xì)胞的HK2，發(fā)現(xiàn)即使給予葡萄糖或G6P刺激，PD-L1表達(dá)依舊減少，表明HK2是葡萄糖誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)的關(guān)鍵。
研究人員對(duì)HK2介導(dǎo)PD-L1表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行了探究。
之前的研究表明，HK2的產(chǎn)物G6P能解救HK2從線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)[6]，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HK2在細(xì)胞質(zhì)中與IκBα結(jié)合，其結(jié)合被G6P促進(jìn)，提示除糖酵解作用外，HK2還通過(guò)其他方式調(diào)控腫瘤細(xì)胞，而這種調(diào)控受到糖酵解影響。
既然HK2能磷酸化葡萄糖，那是否對(duì)IκBα也有激酶活性？
激酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HK2在T291位點(diǎn)磷酸化IκBα，葡萄糖和G6P能提高其磷酸化作用，表明糖酵解不僅促進(jìn)HK2結(jié)合IκBα，還促進(jìn)HK2磷酸化IκBα T291。
然而，與IκBα在T291位點(diǎn)磷酸化水平相反的是，腫瘤細(xì)胞經(jīng)葡萄糖刺激后，IκBα表達(dá)竟然降低。這提示HK2介導(dǎo)的IκBα磷酸化負(fù)性調(diào)節(jié)了IκBα的表達(dá)，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)IκBα T291被HK2磷酸化后在蛋白層面促進(jìn)了IκBα降解。
那么，IκBα蛋白在磷酸化后又是通過(guò)何種方式被降解的呢？
除經(jīng)典的由IKK激酶介導(dǎo)的磷酸化后泛素-蛋白酶體降解途徑外[7]，IκBα還能與蛋白酶μ-calpain結(jié)合并被降解[8]。研究人員對(duì)這兩種方式分別進(jìn)行了檢測(cè)。
IKK磷酸化IκBα的位點(diǎn)在S32和S36，不在T291，而且T291突變不改變IκBα泛素化水平，提示HK2促進(jìn)IκBα降解的機(jī)制不是泛素-蛋白酶體；蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IκBα T291磷酸化后與μ-calpain的結(jié)合增多，抑制μ-calpain能提高T291磷酸化的IκBα蛋白含量。這些結(jié)果表明，IκBα經(jīng)HK2磷酸化后與μ-calpain結(jié)合被降解。
IκBα是NF-κB信號(hào)通路的抑制蛋白，IκBα的降解意味著NF-κB信號(hào)的激活。研究人員對(duì)腫瘤細(xì)胞的NF-κB和PD-L1進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HK2，IκBα蛋白減少，NF-kB入核增多，PD-L1表達(dá)上調(diào)。糖酵解通過(guò)HK2磷酸化IκBα促進(jìn)降解，激活NF-κB上調(diào)PD-L1表達(dá)。
HK2經(jīng)G6P協(xié)助脫離線粒體后結(jié)合并磷酸化IκBα促進(jìn)其降解，激活NF-κB上調(diào)PD-L1表達(dá)
接著，研究人員在體外檢測(cè)了腫瘤細(xì)胞HK2/IκBα對(duì)T細(xì)胞的影響。他們將CD8+T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞的HK2離開(kāi)線粒體磷酸化IκBα后，CD8+T細(xì)胞γ干擾素產(chǎn)生減少，而在腫瘤細(xì)胞IκBα T291位點(diǎn)突變喪失磷酸化后，CD8+T細(xì)胞γ干擾素的生成抑制被解除。這說(shuō)明HK2介導(dǎo)的IκBα T291磷酸化能抑制CD8+T細(xì)胞活化。
然后，研究人員在體內(nèi)驗(yàn)證了HK2/IκBα在腫瘤發(fā)生和免疫逃逸中的作用。腦膠質(zhì)瘤小鼠在HK2過(guò)表達(dá)后腫瘤更大，生存期更短，HK2和IκBα的結(jié)合增多，IκBα T291磷酸化上調(diào)，IκBα蛋白水平降低，PD-L1表達(dá)增加，CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)減少。
而在IκBα T291位點(diǎn)突變后，腦膠質(zhì)瘤小鼠的腫瘤縮小，生存期延長(zhǎng)，PD-L1水平降低，CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)和顆粒酶B表達(dá)增加。這些結(jié)果表明，HK2介導(dǎo)的IκBα T291磷酸化，減少了CD8+T細(xì)胞在腫瘤中的浸潤(rùn)和激活，以及隨后的腫瘤免疫逃避。
最后，研究人員在腦膠質(zhì)瘤中對(duì)靶向HK2的治療進(jìn)行了探索。他們發(fā)現(xiàn)HK2抑制劑和抗PD-1抗體聯(lián)用，比單藥更能抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)生存期，強(qiáng)烈抑制HK2介導(dǎo)的IκBα T291磷酸化和PD-1表達(dá)，顯著提高CD8+T細(xì)胞在瘤體內(nèi)的浸潤(rùn)和顆粒酶B表達(dá)，提示聯(lián)合HK2抑制劑和免疫檢查點(diǎn)阻斷的療法能消除腫瘤免疫逃避。
HK2過(guò)表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤小鼠腫瘤更大，生存期更短
此外，研究人員還通過(guò)自收樣本并結(jié)合線上數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)HK2調(diào)控PD-L1表達(dá)的臨床意義進(jìn)行了驗(yàn)證。在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，HK2 mRNA水平與IκBα T291磷酸化水平和PD-L1 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)和生存期呈負(fù)相關(guān)。
總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究以糖代謝為突破點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了糖酵解限速酶HK2能上調(diào)腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)，闡明了葡萄糖通過(guò)HK2/IκBα/NF-κB/PD-L1信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤免疫逃逸的機(jī)制，并在動(dòng)物模型中證明了抑制HK2能增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)的浸潤(rùn)和活化，提高免疫治療療效，改善預(yù)后。
葡萄糖通過(guò)HK2/IκBα/NF-κB/PD-L1促進(jìn)腫瘤免疫逃逸機(jī)制示意圖
HK2不僅能作為糖代謝酶參與糖酵解，還能作為蛋白激酶參與腫瘤免疫逃逸。這為遏制腫瘤免疫逃逸，提高免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效提供了新的靶點(diǎn)和思路。
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